Нарушение циркадианных ритмов в HCT116, MDA-MB-231, MCF7 и HEK293

1. Резюме

Резюме: циркадианные часы в четырёх целевых линиях и доминирующие оси кросс-тока

Четыре разбираемые линии занимают принципиально разные точки спектра «часовой компетентности», и это различие — не техническая деталь, а причинный фактор, определяющий, как каждая линия отвечает на модуляцию часов. HCT116 (CRC; KRAS/PIK3CA-mut, p53-wt) — единственная из четырёх, где ядро часов показано как функциональный, манипулируемый регулятор онкофенотипа прямо в самой линии: изогенные нокауты ARNTL/PER2/NR1D1 меняют пролиферацию и инвазию через ось NR1D1/REV-ERBα–MACC1 [35884519], перестраивают альтернативный сплайсинг hallmark-генов рака [35552415] и сдвигают EMT-баланс [34065633][34727291]. MDA-MB-231 (TNBC, basal, p53-mut) стоит на противоположном полюсе — надёжно арритмична, автономных осцилляций core-clock не поддерживает [32706791][41133664]; здесь часы изучаются как отсутствующая функция, чьё фармакологическое восстановление (нобилетин) подавляет онкопризнаки [32706791]. MCF7 (люминальный ER+, p53-wt) занимает промежуточное положение: прежняя картина «аритмии» скорректирована — ритм не утрачен, а демпфирован до низкой амплитуды [31357909], и его главная особенность — утрата циркадианной осцилляции самого ESR1/ERα [22193044]. HEK293/HEK293T — не опухолевая, а инструментальная модель: слабый свободнобегущий осциллятор [41746989], ценный именно как хозяин для реконструкции CLOCK-BMAL1-трансактивации, E-box-репортёров и фосфорегуляции часовых белков, а не как источник эндогенного ритма.

Ключевая методологическая честность обзора: объём прямых, в-названной-линии данных резко неравномерен между осями кросс-тока. Наиболее плотно заякорены две оси. Первая — p53: модуль PER2–p53–MDM2 (PER2 перехватывает MDM2, стабилизируя p53) и «воротирование» генотоксического ответа p53 биохимически закреплены именно в HCT116(p53+/+) и p53-null H1299, с нетрансформированными HEK293/CHO в базовой панели [25103245][25411341]. Вторая — Wnt/β-catenin в HCT116: реципрокная петля PER2 ⇄ β-catenin с выходом на c-Myc и cyclin D показана прямо в HCT116 [19010825], хотя обратное плечо (β-catenin → β-TrCP → деградация PER2) собрано из мышиной ApcMin-модели, а не из линии.

Для оси RAS/RAF/MEK/ERK возникает показательный парадокс адресности. HCT116 и MDA-MB-231 несут онкогенные драйверы этого каскада (KRAS/BRAF), но прямого доказательства clock↔RAS именно в этих линиях в верифицированных источниках нет; при этом единственное прямое, в-названной-линии доказательство фосфорегуляции корового белка часов со стороны MAPK — фосфорилирование BMAL1 по Thr534 с подавлением E-box-трансактивации — получено в HEK293 [11687575], то есть в линии без онкогенного RAS-контекста. Каскад как entraining-вход и фосфорилирование CRY-репрессоров установлены на NIH-3T3 и мышиных системах [10733524][15298678] — общемеханистично, но не в фокусных опухолевых линиях.

Ось метаболизма покрыта асимметрично и почти исключительно в двух линиях. Самое чистое клеточно-специфичное доказательство циркадного контроля эффекта Варбурга получено в MDA-MB-231: репрессор CRY подавляет PDK1, а экзогенный CRY1 снижает потребление глюкозы и рост [38199564]. В колоректальном контексте метаболическая ось замыкается через ферроптоз: ARNTL2 (BMAL2) напрямую активирует SLC7A11, подавляя ферроптоз и обеспечивая 5-FU-резистентность (функциональные линии HCT116/SW620 — деталь полного текста) [40753759][39268727]. Многие громкие метаболические результаты (melatonin–BMAL1–ALDH3A1, NSCLC/BMAL1–MRP1) в рефератах не называют конкретную линию и потому не приписываются ни MCF7, ни MDA-MB-231.

Три оси остаются в целевых линиях почти или полностью пустыми на прямом уровне. HIF1α: молекулярная основа (общие партнёры bHLH-PAS, неканоническая гетеродимеризация HIF/BMAL1, реципрокная BMAL1/CRY ⇄ HIF1α регуляция) сильна, но получена на нейробластоме, миотубах и фибробластах [35695677][41362097] — прямой clock↔HIF-эксперимент ни в HCT116, ни в линиях РМЖ не показан. Транскрипция/хроматин на геномном уровне: весь clock-цистром, профили Pol II и гистоновых меток получены в печени мыши [22936566][24591654] — полногеномного clock-цистрома ни в одной из четырёх линий нет; в MCF7, однако, есть прицельные промотор-уровневые данные (ERα ⇄ CLOCK, PER2 → деградация ERα, CLOCK → ацетилирование p65 → PD-L1) [24789043][23160374][17599055][41261416]. PI3K/AKT/PIP3: несмотря на то что HCT116 (PIK3CA-mut) — идеальная модель, узел GSK3β и весь crosstalk PI3K/AKT ↔ часы задокументированы на фибробластах/печени/обзорах [38336976][33941065][20049328], без прицельных экспериментов в фокусных линиях.

Итоговая рамка для читателя: прямая доказательная база концентрируется в HCT116 (p53, Wnt, splicing, ферроптоз/CRC-метаболизм) и в MDA-MB-231 (арритмия как фенотип, Варбург через CRY–PDK1); MCF7 держится на промоторных ER-часовых узлах; HEK293 несёт прямое MAPK→BMAL1 и служит биохимической платформой. Всё, что касается HIF1α, геномного хроматина и PI3K/PIP3 в этих линиях, на сегодня — экстраполяция с общих или иных моделей, и это следует держать явным при переносе схем на клинику.

2. Сводная таблица «клеточная линия × ось регуляции»

3. Методология и охват

Как построен обзор. Тема разложена на 12 «дорожек» поиска (4 клеточные линии + 8 осей кросс‑регуляции) и обработана многоагентным конвейером: поиск → состязательная верификация каждой ссылки → критик полноты → 8 углублённых «дорожек» по обнаруженным пробелам → синтез. Всего отработало 42 агента, ~3,4 млн токенов, 446 обращений к инструментам.

Источники и верификация. Первичный поиск — Europe PMC REST (resultType=core, абстракты) с резервом на NCBI E‑utilities. На этапе верификации каждый агент повторно резолвил PMID и отбрасывал утверждения, чьи абстракты не подтверждали заявленное (всего отброшено 6 утверждений — см. §6). Дополнительно все 298 итоговых PMID независимо перепроверены в NCBI батч‑запросом: 0 нерезолвящихся, 0 несовпадений заголовков — галлюцинированных ссылок не обнаружено.

Честность охвата. Для каждого факта различается уровень доказательства: direct‑in‑named‑cell‑line (работа реально использовала HCT116 / MDA‑MB‑231 / MCF7 / HEK293), other‑cancer‑model (родственная, но иная модель) и mechanistic‑general (механизм уровня пути, не привязанный к этим линиям). Там, где для конкретной линии прямых данных нет, это указано явно — отсутствие данных само по себе результат. Многие связки (особенно «часы × PIP3/AKT» и «часы × HIF‑1» в конкретной линии) опираются на общемеханистические или иномодельные данные; это отмечено в разделах и в §5.

Ограничения. Обзор построен по абстрактам (не по полным текстам), покрывает публикации на дату составления и не заменяет ручного чтения первоисточников для дизайна экспериментов.

Часть I. Статус молекулярных часов по клеточным линиям

Циркадианные часы в HCT116 и родственных моделях колоректального рака

1. Ядро часов управляет пролиферацией и инвазией непосредственно в HCT116

Наиболее прямые данные по линии HCT116 получены на изогенных нокаутах/нокдаунах генов ядра часов. Нокаут или нокдаун ARNTL (BMAL1), PER2 или NR1D1 в HCT116 (параллельно в SW480 и SW620) изменяет пролиферацию и инвазию через двунаправленное взаимодействие с драйвером метастазирования MACC1: белок MACC1 в HCT116 дикого типа экспрессируется циркадианно, но этот ритм исчезает после нокаута часовых генов, причём выявлено прямое белок-белковое взаимодействие MACC1-NR1D1; нокаут MACC1 укорачивает период осцилляций, а его сверхэкспрессия удлиняет [35884519]. Таким образом, связь «часы ↔ метастатическое поведение» в HCT116 замыкается именно через NR1D1/REV-ERBα и MACC1 [35884519].

Нокдаун BMAL1 (shRNA) в HCT116 и SW480 (но не в метастатической SW620) сдвигает эпителиально-мезенхимальный баланс в сторону эпителиального состояния — повышает E-cadherin, CK-20 и EpCAM и снижает Twist, N-cadherin и vimentin, — что уменьшает миграцию, инвазию и химиорезистентность; при этом у пациентов с CRC с высокой экспрессией BMAL1 обогащены EMT- и инвазивные сигнатуры [34065633]. В той же линии BMAL1 стимулирует секрецию экзосом, транскрипционно активируя Rab27a (подтверждено люциферазным репортёром): нокдаун BMAL1 в HCT116 снижает выход экзосом и их промиграционную активность, очерчивая ось BMAL1 → Rab27a → экзосомы в метастазировании CRC [34727291]. Оба результата согласованно указывают на про-онкогенную (EMT-поддерживающую) роль BMAL1 именно в HCT116 [34065633][34727291].

Транскриптомный анализ временных рядов RNA-seq нокаутов HCT116 показал, что делеция часовых генов разрушает циркадианную ритмичность ключевых генов сплайсосомы (SF3A1 в ARNTL-KO, SNW1 в NR1D1-KO, HNRNPC в PER2-KO; U2AF1 теряет ритм во всех нокаутах) и порождает KO-специфичный аберрантный альтернативный сплайсинг генов-hallmark'ов рака — FGFR2 (ARNTL-KO), CD44 (NR1D1-KO) и MET (PER2-KO), — коррелирующий с EMT-сигналингом [35552415]. Это связывает нарушение часов в HCT116 с посттранскрипционной перестройкой онкогенных программ [35552415].

2. Амплитуда/фаза/период часов в HCT116 модулируются фармакологически, что меняет чувствительность к гибели

Часы в HCT116 характеризуются как функциональный, но податливый осциллятор: липофильный экстракт листьев Cynara cardunculus напрямую меняет фазу, амплитуду и длину периода осцилляций часовых генов и подавляет пролиферацию, вызывая цитотоксичность и апоптоз в зависимости от того, какой именно ген ядра часов (BMAL1, PER2 или NR1D1) нокаутирован, — то есть часы в HCT116 модулируют апоптотическую лекарственную чувствительность [36012399]. С противоположной стороны, фармакологическое усиление ритмичности (дексаметазон) в HCT-116 восстанавливает ритмичную экспрессию часовых и клеточно-цикловых генов и снижает пролиферацию по образцу меланомы B16, где дексаметазон сдвигал клетки из S-фазы в G1 и замедлял рост опухоли BMAL1-зависимым образом; при этом собственно доказательство BMAL1-зависимости получено на B16 (нокдаун Bmal1 отменял эффект), а HCT-116 демонстрировала «сходный» антипролиферативный ответ [28196531]. Важно, что во всех этих работах амплитуда/фаза/период HCT116 измерены как следствие нокаута или лекарственного воздействия, а не как нативное сравнение «опухоль против нормального эпителия» [36012399][28196531].

3. BMAL1 как онкоген в CRC-клетках (линия в абстракте не названа)

В CRC-клетках (конкретная линия в аннотации не указана) BMAL1 ведёт себя как онкоген: сверхэкспрессия усиливает пролиферацию и миграцию и активирует EMT, высвобождая β-catenin для индукции онкогена c-Myc через MAPK-путь (ERK1/2 и JNK); молчание BMAL1 даёт обратный эффект, а ингибиторы ERK/JNK блокируют индукцию c-Myc — что определяет ось BMAL1 → MAPK → c-Myc [36806631]. Этот механизм концептуально согласуется с про-EMT-ролью BMAL1, наблюдаемой напрямую в HCT116 [34065633][36806631], но сам по себе не является HCT116-специфичным.

4. Часы, метаболизм и химиорезистентность в CRC (модели вне HCT116)

Несколько работ связывают часы с лекарственной устойчивостью на CRC-линиях, отличных от HCT116. Родственный часам ген ARNTL2 (BMAL2) сверхэкспрессирован в раке толстой кишки и повышает устойчивость к 5-фторурацилу, напрямую связываясь с промотором SLC7A11 (и стабилизируя его мРНК через PHGDH), тем самым подавляя ферроптоз; мелатонин разрушает ARNTL2 по убиквитин-протеасомному пути, демонтируя ось ARNTL2-SLC7A11 [40753759]. В условиях гипоксии (CoCl2) в CRC-линиях DLD1 и LoVo HIF-1α повышает BMAL1, который увеличивает гликолитический фермент ALDOC; каскад HIF-1α/BMAL1/ALDOC усиливает гликолиз и снижает апоптоз, понижая чувствительность к оксалиплатину, а ко-экспрессия HIF-1α/ALDOC подтверждена в клинических образцах CRC [40535800]. На системном уровне интегративная математическая модель, построенная на данных временных рядов трёх CRC-линий и их нокаутов ядра часов, сопрягает сети часов и метаболизма лекарств и предсказывает специфичную по типу клеток и по времени токсичность химиотерапии, показывая, что внешние Zeitgeber'ы (например, свет) можно использовать для настройки токсичности [37353516].

5. Эпигенетическое и посттранскрипционное подавление PER/CRY в раке толстой кишки (ткань/другие модели, не HCT116)

Прямых работ по метилированию промоторов PER/CRY именно в линии HCT116 в подтверждённой литературе нет; ближайшие CRC-релевантные данные — тканевые и на других линиях. Гиперметилирование промотора PER3 (CpG-острова cg12258811 и cg14204433) снижает экспрессию PER3 пан-канцерно, и аденокарцинома толстой кишки (COAD) входит в число шести раков, где эта корреляция «гиперметилирование ↔ замолкание» подтверждена; гиперметилирование cg12258811 сопряжено с продвинутой стадией и меньшей выживаемостью, а деметилирующий агент децитабин восстанавливает экспрессию PER3 — при этом функциональная валидация выполнена на линиях почки и лёгкого (KIRP/LUAD), а не на HCT116 [39402618]. Посттранскрипционный маршрут показан в трансформированной ткани толстой кишки мужчин: пол-смещённые онкогенные miRNA (miR-24, miR-92a, miR-181a, miR-21 — на PER2; miR-93, miR-17, miR-20a, miR-24 — на CRY2) повышены и подавляют часовые гены PER2/CRY2, а подавление PER2 дополнительно снижает опухолевые супрессоры PTEN и p53 — обеспечивая пол-зависимую (не наблюдаемую у женщин) прогрессию CRC [39134242]. Это единственная подтверждённая линия связи «часы → p53» в толстой кишке, и она получена на пациентской ткани через miRNA-корреляции, а не в HCT116 [39134242].

Вспомогательные (не-CRC) модели очерчивают консервативный опухоль-супрессорный профиль PER/CRY, релевантный сниженной экспрессии PER в CRC. PER3 подавляет пролиферацию/миграцию аденокарциномы лёгкого через активацию AMPK/mTOR (рост p-AMPK, снижение p-mTOR); сверхэкспрессия PER3 тормозит, а молчание — стимулирует злокачественное поведение [41286322]. CRY1 действует как опухолевый супрессор в гепатоцеллюлярной карциноме, запуская апоптоз по оси BAX/BCL2 (CRY1 повышает BAX и снижает BCL2) [41142939]. Обзорный синтез подтверждает, что белки PERIOD (PER1/2/3) регулируют пролиферацию, апоптоз и миграцию опухолевых клеток через уровни клеточно-цикловых белков и стимуляцию онкогенов c-Myc и MDM2, тогда как PER2/PER3 выступают антагонистами в биологии раковых стволовых клеток [39825442].

6. Циркадианный контроль репарации ДНК и радиочувствительности (общий механизм)

CRY1 накладывает циркадианный ритм на выбор пути репарации двунитевых разрывов ДНК в человеческих клетках: резекция концов ДНК (ключевой шаг гомологичной рекомбинации) осциллирует с пиком утром и провалом днём, и CRY1 — фосфорилируемый DNA-PK — ограничивает резекцию к ночи, модулируя анти-резекционную активность CCAR2 для сдерживания CtIP; это циркадианное демпфирование HR влияет на прогрессию опухолей и ответ на лучевую терапию [41326346]. Механизм описан как общеклеточный (human cells), не специфичный для HCT116 [41326346].

7. Циркадианное нарушение и опухолевое микроокружение при CRC

Одноклеточная/пространственная транскриптомика правостороннего CRC показывает, что опухолевые клетки имеют значимо более высокие оценки нарушения циркадианного ритма и порождают NONO-позитивную субпопуляцию; NONO выступает одновременно циркадианным регулятором и про-опухолевым хабом, перепрограммируя опухолевые клетки в эффективных «приёмников» сигналов миофибробластических CAF, связывая циркадианную дисрегуляцию со злокачественной опухоль-фибробластной нишей [41174721]. Согласованно, ко-культура клеток рака толстой кишки с пациент-производными опухоль-ассоциированными фибробластами (против нормальных) меняет циркадианные и метаболические параметры раковых клеток и усугубляет злокачественность — снижает апоптоз, повышает жизнеспособность и устойчивость к химиопрепаратам, — показывая, что строма демпфирует/перепрограммирует внутренние часы опухоли [31311174].

8. Системно-модельная перспектива и обзорный контекст

Стохастическое моделирование сопряжённых осцилляторов «часы + клеточный цикл» показывает, что установленная сеть часовых генов достаточна для генерации «терапевтического окна» между пиками пролиферации рака и нормы, и предсказывает, что CRY-стабилизирующий ингибитор часов KL001 почти не меняет рост популяции, но сильно перестраивает линейные корреляции клеточного цикла — то есть контроль часов над пролиферацией может присутствовать, но быть невидимым в объёмных ростовых анализах [40241744]. Это методологически важно для HCT116: отсутствие эффекта на bulk-рост не исключает часового контроля клеточного цикла [40241744]. Фокусный обзор часовых генов при CRC обобщает, что петля обратной связи BMAL1/CLOCK/PER1-2-3/CRY1-2 деregulирована в CRC и стимулирует онкогенез через контроль клеточного цикла, EMT и метаболической перестройки, механистически — через Wnt/β-catenin и c-Myc/p21, связывая циркадианное нарушение с диагностикой, прогнозом и химиочувствительностью CRC [41595646].

Пробелы/неопределённости

• Нативная амплитуда/затухание в HCT116. Ни одна подтверждённая работа не измеряет базовую циркадианную амплитуду/затухание осцилляций в HCT116 в сравнении с нормальным эпителием толстой кишки; изменения амплитуды/фазы/периода в HCT116 зафиксированы только как следствие нокаута ядра часов [35884519][36012399] или лекарственного/экстрактного воздействия [36012399][28196531], но не как сравнение «опухоль против нормы».
• Эпигенетическое замолкание PER/CRY именно в HCT116. Нет подтверждённого первичного исследования метилирования промоторов PER1/PER2/PER3/CRY1/CRY2 в линии HCT116; сильнейшие CRC-релевантные данные (гиперметилирование PER3) получены на ткани COAD с функциональной валидацией на линиях почки/лёгкого [39402618].
• Генотип-специфичная (p53-wt) биология. Ни одна подтверждённая работа не использует p53-дикий статус HCT116 для прямой проверки p53-зависимого циркадианного механизма в этой линии; связь «часы → p53» в толстой кишке выведена только из miRNA-корреляций в пациентской ткани [39134242].
• Прямая REV-ERBα/ROR-фармакология в HCT116. NR1D1/REV-ERBα в HCT116 фигурирует только как нокаут для считывания сплайсинга, взаимодействия с MACC1 и лекарственной чувствительности [35884519][35552415][36012399]; прямых данных по агонистам/антагонистам REV-ERB (например, SR9009/SR9011) в HCT116 в подтверждённой выборке нет.
• CLOCK отдельно от BMAL1 и эндогенные ритмы PER/CRY. Прямого измерения потери функции CLOCK (в отличие от BMAL1) на пролиферацию/апоптоз в HCT116, равно как и характеристики свободнотекущих ритмов эндогенных PER1/2/3 и CRY1/2 в невозмущённой HCT116, среди подтверждённых находок нет; часть механизмов (BMAL1→c-Myc [36806631], CRY1→HR [41326346], PER→c-Myc/MDM2 [39825442]) описана на других CRC-линиях, других раках или как общий механизм и на HCT116 напрямую не проверена.

Циркадианные часы в MDA-MB-231 (TNBC, basal, KRAS/BRAF, p53-mut): статус осцилляций, экспрессия и функциональные эффекты

Базовый статус осцилляций

На базовом уровне MDA-MB-231 арритмична: линия не поддерживает автономных циркадианных осцилляций, тогда как U2OS обладает робастным ритмом, а MCF7 — слабым [32706791]. Репортёрные измерения подтверждают это на уровне ядра часов: осцилляции core-clock генов BMAL1 (ARNTL) и PER2 арритмичны в MDA-MB-231 и лишь слабы в MCF7, при робастной экспрессии в непревращённой MCF10A; экспрессия SNAIL (SNAI1), считанная репортёром SNAIL:luc, отслеживает статус ядра часов и также арритмична в наиболее агрессивной линии MDA-MB-231 [41133664]. Панельное «глубокое циркадианное фенотипирование» 14 линий РМЖ формализовало эту гетерогенность в четыре класса часов — functional, weak, unstable, dysfunctional — и показало, что сила/устойчивость часов формирует фармакологический ответ на противоопухолевые препараты; «функциональный» класс включал эпителиальную MCF10A, две luminal-A и две TNBC-BL1 линии, то есть дисфункция часов линие-специфична, а не универсальный признак TNBC [39994450]. Важная оговорка по верификации: в абстракте и доступном полном тексте этой работы MDA-MB-231 не отнесена явно к dysfunctional-классу и не заявлено об отсутствии в ней осцилляций BMAL1/PER2 (авторы даже отмечают, что TNBC-линии могут демонстрировать измеримые ритмы); собственно арритмичность MDA-MB-231 надёжно подтверждается независимо в [32706791] и [41133664], а не этой панельной работой.

Уровни clock-белков и синтез мелатонина (ASMT): часы как ПРО-инвазивный фактор

Белки CLOCK, BMAL1 и PER1 экспрессированы в MDA-MB-231 (triple-negative) на более низком уровне, чем в BT-474 (triple-positive) [33194597]. Фермент синтеза мелатонина ASMT поддерживает уровни этих clock-белков: нокдаун ASMT снижает CLOCK/BMAL1/PER1 и уменьшает миграцию и инвазию MDA-MB-231, причём эффект реверсируется гиперэкспрессией CLOCK; при этом уровни clock-белков в тканях росли с лимфатической инвазией [33194597]. В этом TNBC-контексте часы, таким образом, выступают ПРО-инвазивно, а не супрессивно.

BMAL1 — противоречивая, контекст-зависимая роль

CRISPR-нокаут BMAL1 непосредственно в инвазивной MDA-MB-231 усиливал её инвазивные свойства и одновременно сенсибилизировал к ДНК-повреждающим агентам — цисплатину и доксорубицину; тот же нокаут в нетуморогенной MCF10A давал химиосенсибилизацию без про-инвазивного эффекта, что авторы формулируют как «противоположные канцерогенные эффекты» гена часов в зависимости от контекста [30375470]. Здесь направление «потеря BMAL1 → рост инвазии» указывает на супрессорную (для инвазии) роль часов и прямо противоречит про-инвазивной роли clock-белков, вытекающей из ASMT-работы [33194597]; ни одно из ретривнутых исследований не примиряет эти два направления в одном TNBC-контексте.

PER2 — транскрипционный корепрессор EMT

PER2 действует как транскрипционный корепрессор, рекрутирующий поликомб-белки EZH2 и SUZ12 и HDAC2 к OCT1(POU2F1)-сайтам промоторов TWIST1 и SLUG (SNAI2); потеря PER2 усиливает инвазию и де-репрессирует EMT-гены TWIST1, SLUG и SNAIL, а гипоксия деградирует PER2, разбирая репрессорный комплекс и запуская EMT [23836662]. Панель включала MDA-MB-231 (наряду с SKBR-3, MCF-7, MDA-MB-157, MCF-10A); принципиально, что ре-экспрессия PER2 НЕ подавляла инвазию именно MDA-MB-231 (в отличие, например, от SKBR-3) — авторы прямо связывают это с множественными конститутивно активными EMT-путями в этой линии [23836662]. То есть в MDA-MB-231 документирован только про-малигнантный эффект потери PER2, но не реверс злокачественности его восстановлением.

PER1 — опухолевый супрессор через MEK5/ERK5

PER1 работает как супрессор через путь MEK5/ERK5: гиперэкспрессия PER1 в MDA-MB-231 снижала фосфорилирование ERK5 (p-ERK5), тогда как нокдаун PER1 (в MCF7 и BT-549) повышал пролиферацию, миграцию и инвазию, и этот прирост снимался специфическим ингибитором ERK5 XMD17-109; низкий уровень PER1 в опухолевой ткани предсказывал худшую общую и безрецидивную выживаемость [40809954].

ROR/нобилетин — терапевтическая ось в TNBC

В MDA-MB-231/TNBC активация ROR нобилетином подавляет пролиферацию и подвижность in vitro и в ксенографтах; согласованные loss- и gain-of-function ROR подтверждают ось [35440077]. Механистически ROR связывается с RRE-элементом промотора IκBα и блокирует ядерную транслокацию p65/NF-κB; принудительная экспрессия p65 отменяет эффект, а нобилетин аддитивен к доцетакселу [35440077]. Это согласуется с наблюдением, что нобилетин восстанавливает ритмичность и существенно снижает 2D-подвижность и якорь-независимый рост именно в MDA-MB-231, давая лишь тонкие эффекты в ритм-робастной U2OS и слабо-ритмичной MCF7 [32706791].

KLF9 — связка гормональной дисрегуляции и часов

Ритмическая экспрессия KLF9, видимая в MCF10A, утрачена в агрессивной MDA-MB-231; форсированная экспрессия KLF9 меняет базовую и гормон-зависимую (глюкокортикоид/эстроген, GC/E2) экспрессию core-clock генов, то есть KLF9 выступает регулятором самих часов [36823570]. KLF9 опухоле-супрессивен вне зависимости от молекулярного подтипа (подавляет пролиферацию/миграцию, способствует апоптозу), а в MDA-MB-231 сдерживает GC-усиленную онкогенность [36823570].

Контекст за пределами named MDA-MB-231 (обобщения, требующие осторожности)

Синтетический агонист REV-ERBα/β SR9011 подавлял пролиферацию линий РМЖ независимо от ER/HER2-статуса, включая triple-negative, без эффекта на нетуморогенную MCF10A, через репрессию прямой мишени cyclin A (CCNA2) и арест клеточного цикла перед M-фазой; MDA-MB-231 индивидуально среди TNBC-линий не назван [26074263]. Контроль стволовости часами показан только в мышиной модели: в 4T1 CLOCK пост-транскрипционно репрессируется через miR-182 в ALDH-high стволоподобных клетках, а усиление CLOCK снимает стволовость (туморогенность/инвазивность), нокаут miR-182 восстанавливает CLOCK и подавляет рост опухоли [33890571]. Транскрипционно-репрессивный комплекс PRMT6/PARP1/CRL4B (CUL4B) со-занимает промотор core-clock гена PER3, нарушая осцилляцию и стимулируя пролиферацию и метастазирование РМЖ, тогда как ингибитор PARP1 олапариб восстанавливает экспрессию clock-генов [36941223]. В luminal-A опухолях/органоидах ритмы сохраняются, но приглушены/перепрограммированы; контринтуитивно высокая глобальная сила ритма (CYCLOPS magnitude) сопряжена с усиленным циклированием EMT-генов и СНИЖЕННОЙ 5-летней выживаемостью, а молекулярная дизрупция часов снижает инвазию в 3D luminal-A культурах — эффект подчёркнуто подтип-специфичен и не переносится на TNBC/MDA-MB-231 [38319971]. Из восьми дифференциально экспрессированных circadian-генов между non-TNBC и TNBC только ARNTL2 (BMAL2) нёс независимую прогностическую ценность (общая и безрецидивная выживаемость) в TNBC и коррелировал с иммунной инфильтрацией — это биоинформатический результат по TCGA/GEO, а не клеточный эксперимент в MDA-MB-231 [34785930]. Мелатонин повышает BMAL1, который супрессирует гликолиз через downstream-мишень ALDH3A1 (анти-пролиферативно и про-апоптотично), — ось melatonin-BMAL1-ALDH3A1 показана в MCF7 и SKBR3 (с синергией REV-ERB-антагониста SR8278); MDA-MB-231 не использовалась, и авторы прямо отмечают, что применимость оси к TNBC требует дальнейшей верификации [41228459]. CRY1 является прямой мишенью Hippo-эффектора YAP/TEAD и обратным регулятором Hippo: в клетках РМЖ (линия не указана) снижение CRY1 вызывает гиперактивацию YAP/TAZ и рост ДНК-повреждений [37593458]. На уровне «опухоль vs норма» BHLHE40, CIART, CLOCK, PDPK1 и TIMELESS сверхэкспрессированы, а HLF, NFIL3, NPAS3, PER1, PER3, SIM1 и TEF снижены; даун-регуляция PER1/TEF и ап-регуляция CLOCK связаны с повышенным риском РМЖ, с circadian-miRNA (miR-10a, -21, -107, -34) как пост-транскрипционными регуляторами [39201344]. Обзорный синтез описывает, как circadian TTFL контролирует холлмарки РМЖ (клеточный цикл, репарация ДНК, ангиогенез, метаболизм) и как хрономодуляция химиотерапии может повышать эффективность — это рамочный уровень, без первичных данных по MDA-MB-231 [42101677].

Пробелы/неопределённости

• Прямого теста восстановления/гиперэкспрессии PER2 для РЕВЕРСА злокачественности именно в MDA-MB-231 нет; единственный прямой тест показал, что ре-экспрессия PER2 НЕ подавляет инвазию MDA-MB-231 (линия уже высоко-мезенхимальна) — документирован лишь эффект потери функции [23836662].
• Нет прямых манипуляций CRY1/CRY2 в named MDA-MB-231; работа CRY1-Hippo/YAP использовала неуказанные «breast cancer cells» [37593458].
• Нет эксперимента с нокдауном или агонизмом REV-ERB (NR1D1) с явным упоминанием MDA-MB-231; SR9011 тестировался на панели ER/HER2/TNBC, но MDA-MB-231 индивидуально не назван [26074263].
• Контроль стволовости (ALDH+/самообновление) часами продемонстрирован только в мышиной 4T1 [33890571]; MDA-MB-231-специфичной связи BMAL1/CLOCK/PER-манипуляций со стволовостью нет.
• BMAL1 gain-of-function/восстановление в MDA-MB-231 не тестировали — только CRISPR-нокаут [30375470]; способен ли реставрированный ритм BMAL1 обратить мезенхимально-инвазивный фенотип, неизвестно.
• Направление роли clock-белков в TNBC противоречиво и не разрешено: нокаут BMAL1 усиливает инвазию MDA-MB-231 (супрессорная роль часов [30375470]) при том, что ASMT-поддерживаемые CLOCK/BMAL1/PER1 положительно связаны с лимфатической инвазией и поддерживают миграцию/инвазию (про-инвазивная роль часов [33194597]).
• Систематического количественного атласа полного набора core-clock генов в MDA-MB-231 vs нормальный эпителий vs luminal-подтипы (за пределами отдельных белков в ASMT-работе и панельного фенотипирования [39994450]) нет; отдельно отмечу, что [39994450] в доступном тексте не подтверждает конкретное отнесение MDA-MB-231 к dysfunctional-классу — этот пункт исходного черновика верификацию не прошёл и опирается на [32706791]/[41133664].
• Связь драйверных мутаций линии (KRAS, BRAF, TP53) с дисфункцией её часов ни в одной из ретривнутых работ не исследована.

Циркадианные часы в клетках MCF-7 (люминальный ER+ рак молочной железы, p53-wt)

1. Состояние часов: не «аритмия», а демпфированный (низкоамплитудный) ритм

Классические данные RT-qPCR/вестерн-блот формировали картину, в которой у MCF-7 базовый осциллятор «выключен». В стандартных условиях культивирования осцилляция clock-генов не регистрируется вовсе; serum-shock (50% лошадиная сыворотка, 2 ч) индуцирует ритмическую экспрессию core-clock-генов и clock-controlled-генов в непухолевых MCF-10A, но в MCF-7 эта индукция репрессирована/нарушена [23012497]. В той же логике при serum-shock-синхронизации нормальные маммарные эпителиальные клетки удерживают внутренний осциллятор — включая циркадианную осцилляцию мРНК самого ERα (ESR1), — тогда как ER+ линии рака (в полнотекстовой части работы это прямо MCF-7 и T47D) демонстрируют дезинтеграцию внутренних часов и, что принципиально, отсутствие циркадианной осцилляции экспрессии ERα; это трактуется как потеря ритмической «доступности» ERα и разрегуляция тайминга эстрогенового сигналинга именно в ER+ опухолях, а не только в ER− [22193044].

Эта «плоско-аритмическая» интерпретация была скорректирована при переходе на чувствительные люциферазные репортёры. С репортёрами BMAL1 и PER2 показано, что низкозлокачественные люминальные-A клетки MCF-7 сохраняют детектируемые, но НИЗКОАМПЛИТУДНЫЕ (демпфированные) осцилляции BMAL1 и PER2, тогда как высокозлокачественные базальные MDA-MB-231 действительно аритмичны; авторы прямо указывают, что прежние низкоразрешающие RT-qPCR/вестерн-данные ошибочно трактовали ритм MCF-7 как подавленный/отсутствующий — ритм демпфирован, но не утрачен [31357909]. Согласующаяся оценка: MCF-7 обладают лишь СЛАБОЙ базовой ритмичностью, промежуточной между сильно ритмичными U2OS и аритмичными MDA-MB-231, и потому «усилитель амплитуды часов» нобилетин даёт в MCF-7 лишь тонкие циркадианные и анти-пролиферативные/анти-миграционные эффекты, тогда как в аритмичных MDA-MB-231 он восстанавливает ритмичность и существенно подавляет онкогенные признаки — то есть ответ на модулятор часов масштабируется с остаточной «часовой компетентностью» клетки [32706791]. Профилирование люциферазных репортёров подтверждает ту же зависимость от линии/агрессивности для clock-output-гена SNAIL: в MCF-7 SNAIL осциллирует слабо, следуя демпфированному ядру часов (BMAL1/PER2), тогда как в MDA-MB-231 он аритмичен [41133664]. Важная оговорка по этой же работе: в MCF-10A с робастным ядром часов SNAIL, вопреки ожиданию, ритмическим НЕ был, поэтому осцилляция SNAIL диктуется тканеспецифично и не является простым «следом» core-clock во всех линиях [41133664].

Совокупно эти работы дают устойчивый, специфичный для названной линии вывод: часы в MCF-7 не отсутствуют, а демпфированы — это низкоамплитудный люминальный осциллятор, стоящий выше по «часовой компетентности», чем базальные MDA-MB-231, но ниже нетуморогенных эпителиальных клеток.

2. Кросс-ток эстроген ↔ часы

Связь двунаправленна и в значительной части подтверждена прямо в MCF-7.

Часы → ERα. Ген PER2 напрямую сцепляет циркадианную систему с ERα: связывание PER2 усиливает деградацию белка ERα, а снижение уровня PER2 ведёт к стабилизации ERα; при этом PER2 сам является эстроген-индуцируемым (петля отрицательной обратной связи, ограничивающая эстрогеновую стимуляцию), а сверхэкспрессия PER2 в клетках рака молочной железы вызывает выраженное торможение роста, потерю клоногенности и апоптоз [17599055].

Эстроген → часы (проонкогенная ось). E2–ERα-сигналинг прямо индуцирует CLOCK в люминальных ER+ клетках: под действием E2 ERα связывается с ERE в промоторе CLOCK и повышает уровень мРНК и белка CLOCK в ER+ линиях (MCF-7/T47D), а нокдаун CLOCK ослабляет пролиферацию — то есть эстроген-зависимая индукция CLOCK является про-пролиферативной, образуя прямую онкогенную ось «эстроген → часовой ген» [24789043].

TIMELESS как ко-активатор ERα и драйвер эндокринной резистентности. В MCF-7 clock-ген TIMELESS работает как ко-активатор ERα: он связывает ERα через проксимальный LXXLL-мотив, усиливает транскрипционную активность ERα (через повышение PARP1 и PARилирование ERα) и ко-рекрутируется с ERα на промоторы GREB1 и c-MYC — что даёт механистическую основу TIMELESS-опосредованной устойчивости к тамоксифену [29555554]. Функционально TIMELESS гиперэкспрессирован в ER+ раке и в ER+ линиях (MCF-7/T47D) стимулирует пролиферацию и митохондриальное дыхание через ось Sp1 → ACER2 (щелочная церамидаза 2) → сфингозин-1-фосфат, а высокий TIMELESS предсказывает плохой прогноз именно у ER-положительных пациентов [33093451]. Клинико-трансляционное подтверждение (в ERα+ линиях и опухолях, не строго в MCF-7): TIMELESS 17β-эстрадиол-регулируем in vitro и эктопически гиперэкспрессирован в 4-OH-тамоксифен-резистентных линиях, а высокий уровень его мРНК независимо предсказывает более короткую безрецидивную выживаемость на адъювантном тамоксифене — прямое сцепление циркадианного гена с ответом на эндокринную терапию [17909269].

3. Глюкокортикоидный кросс-ток

KLF9 — прямая мишень глюкокортикоидного рецептора в маммарном эпителии, служащая точкой пересечения гормонального сигналинга и циркадианной сети. Форсированная экспрессия KLF9 меняет как базовую, так и GC/E2-зависимую экспрессию ряда clock-генов (то есть KLF9 ведёт себя как регулятор ядра часов), а в ER+ люминальных MCF-7 KLF9 потенцирует анти-туморогенное (ростоподавляющее, проапоптотическое) действие глюкокортикоидов; при этом противоположный эффект (сдерживание GC-усиленной онкогенности) KLF9 даёт в тройной-негативных MCF-10A и MDA-MB-231 — то есть роль оси «гормон–KLF9–часы» субтип-зависима [36823570].

4. PER2/PER-семейство как опухолевый супрессор в MCF-7 (p53-wt)

PER2-белок эндогенно экспрессирован в нормальном маммарном эпителии, но утрачен или резко снижен в линиях рака молочной железы. Реэкспрессия PER2 в p53-wt MCF-7 останавливает клетки в G1, индуцирует апоптоз (рост расщепления PARP), снижает cyclin D1 и повышает p53; ко-экспрессия CRY2 углубляет ростоподавление — что определяет PER2 (в кооперации с CRY2) как функциональный опухолевый супрессор именно в MCF-7 [18334030]. Концептуальная рамка (обобщающая, преимущественно на мышиных mPer1/mPer2 и на опухолевой ткани человека): Period-гены — циркадианно-контролируемые опухолевые супрессоры, сцепляющие часы с регуляторами клеточного цикла (c-Myc, cyclin D1, cyclin A, Mdm-2, Gadd45α), ответом на повреждение ДНК и p53-опосредованным апоптозом, а потеря/дерегуляция PERIOD-белков распространена в раке молочной железы (и эндометрия) [16596306].

5. Онкогенная роль CLOCK за пределами пролиферации

Повышенный CLOCK — независимый фактор неблагоприятного прогноза при раке молочной железы; в MCF-7 высокий CLOCK усиливает пролиферацию и устойчивость к доксорубицину/гемцитабину, а механистически опосредует ацетилирование NF-κB p65 по K56, транскрипционно активируя PD-L1. Нокдаун (sh-CLOCK в MCF-7) подавляет сигналинг NF-κB/TNF/MAPK и PD-L1, снижая иммунное ускользание — то есть в люминальных клетках CLOCK несёт самостоятельную онкогенную (проиммуносупрессивную) функцию, отличную от простой стимуляции роста [41261416].

6. Синхронизация serum-shock и хронотерапия при демпфированных часах

Несмотря на дефектный/демпфированный осциллятор, MCF-7 остаются пригодны для хронофармакологии. После serum-shock-синхронизации MCF-7 демонстрируют статистически значимый 24-часовой ритм активности mTOR при ВОЗМУЩЁННЫХ (ослабленных) осцилляциях core-clock-генов; serum-shock также запускает циркадиано-подобную осцилляцию G1-регуляторов cyclin D1 и фосфо-RB, вследствие чего эффективность mTOR-ингибитора эверолимуса (блок G0/G1) оказывается зависимой от времени введения — рациональная база для хронотерапии ER+ рака молочной железы даже при дефектных часах [29099263].

Методологическая оговорка (критична для интерпретации «демпфирования»). В маммарных эпителиальных клетках (включая MCF-7) именно serum-shock лучше всего сохраняет амплитуду осцилляции clock-генов во времени; при этом стандартные housekeeping-гены могут сами осциллировать, поэтому для нормализации требуются валидированные нециклирующие референсные гены (RPL4, RPLP0, HSPCB, TBP) — иначе измеряемая амплитуда/демпфирование часов смещаются артефактно. Это прямое предостережение при чтении сообщений о «демпфированных» ритмах MCF-7 [30296179].

Пробелы/неопределённости

• Глюкокортикоидная синхронизация именно MCF-7 не показана. Данные по энтрейнменту MCF-7 почти исключительно serum-shock-основанные [23012497; 29099263; 30296179]; дексаметазон/форсколин как самостоятельный протокол синхронизации часов MCF-7 в проверенных источниках не продемонстрирован (документирован лишь в U2OS/фибробластах) — реальный пробел для данного фокус-вопроса.
• CRY1/CRY2 в MCF-7 самостоятельно не охарактеризованы. CRY2 фигурирует только как ко-фактор, углубляющий PER2-зависимое ростоподавление [18334030]; собственная осцилляция, фаза или фенотип нокдауна CRY в MCF-7 не измерены.
• PER1-специфический ритм и функция прямо в MCF-7 не установлены — «периодные» доказательства в MCF-7 доминируются PER2 [17599055; 18334030].
• Осциллирует ли сам TIMELESS в MCF-7 — не измерено. TIMELESS изучен как ко-активатор ERα и драйвер пролиферации/прогноза [29555554; 33093451], но не как ритмически осциллирующий канонический clock-компонент.
• Количественные параметры часов MCF-7 (период, амплитуда, скорость демпфирования) остаются скудными — большинство сообщений описывает ритм лишь качественно, а классическая RT-qPCR/вестерн-литература недооценивала его как «плоско-аритмический», что было исправлено люциферазными репортёрами [31357909].
• Прямое метилирование-зависимое сайленсирование промоторов PER1/PER2 именно в MCF-7 не найдено — эпигенетическое молчание clock-генов документировано в других линиях/опухолевой ткани, но не MCF-7-специфично.

Циркадианные часы в HEK293/HEK293T как модельном хозяине

Сила эндогенного осциллятора: HEK293T — слабый свободнобегущий генератор ритма

Прямое транскриптомное исследование в самой линии показывает, что собственная циркадианная ритмичность HEK293T выражена слабо. После синхронизации и RNA-seq в 13 временных точках на протяжении 48 ч глобальный транскриптом обнаруживал чёткое разделение по времени (PCA), однако расхождение между биологическими репликами резко возрастало начиная с T28; канонические core-clock-гены (BMAL1/PER/CRY и др.) не демонстрировали детектируемой циркадианной ритмичности при расширении окна анализа за пределы ~28 ч, и по всему геному ритмичными оказались лишь 785 экспрессируемых генов — то есть HEK293T является слабым свободнобегущим осциллятором [41746989]. Это ключевое методическое ограничение: линия удобна как экспрессионный хозяин, но не как самоподдерживающийся часовой генератор.

HEK293/HEK293T как хозяин трансактивационного комплекса CLOCK-BMAL1 и репрессии CRY/PER

Линия используется преимущественно именно как удобная система ко-трансфекции, ко-иммунопреципитации и E-box-репортёрных анализов, а не из-за наличия сильных собственных часов. Так, редкие миссенс-варианты CRY2 на ободе вторичного кармана (P123L, D406H, S410I) в HEK293T теряют способность репрессировать управляемую CLOCK/BMAL1 транскрипцию в клеточном E-box-репортёре, обнаруживают сниженное сродство к CLOCK-BMAL1 и сниженную стабильность (спасаемую ко-экспрессией PER2), а также нарушенную ядерную локализацию; восстановление клеточного ритма проверяли отдельно в Cry1/Cry2 dKO MEF [35933018].

Протеинфосфатаза PPP4 (с регуляторной субъединицей PPP4R2) связывает BMAL1 и противодействует его фосфорилированию, повышая занятость ДНК комплексом CLOCK/BMAL1, но снижая его трансактивационную активность; депления PPP4 укорачивает, а сверхэкспрессия удлиняет период. HEK293 был одной из линий (наряду с U2OS и NIH3T3) в этом RNAi/биохимическом скрининге трансактивационного комплекса CLOCK/BMAL1 [34301769].

Ряд базовых механизмов трансактивационного комплекса при этом установлен НЕ в HEK293. Ко-зависимое (взаимное) фосфорилирование CLOCK и BMAL1, сопряжённое с ядерной транслокацией и деградацией CLOCK и происходящее только внутри активного трансактивационного комплекса, показано на мышиных эмбриональных фибробластах (MEF) и при эктопической ко-экспрессии [12897057]. Модулятор PCBP1, усиливающий ассоциацию CRY1 с CLOCK/BMAL1 и укорачивающий период при нокдауне, охарактеризован в человеческих U2OS, а не в HEK293 [33841513]. Наконец, малая молекула CCM (Core Circadian Modulator), связывающая полость PASB-домена BMAL1, расширяющая её и дозозависимо изменяющая PER2-Luc-осцилляции, описана как общий структурно-фармакологический механизм прямого таргетирования комплекса BMAL1-CLOCK [40133642].

CK1δ/ε-фосфорилирование PER: HEK293 — основной хозяин белково-стабилизационных анализов

Именно на HEK293 сформулирована значительная часть модели CK1-контроля PER. Классически казеинкиназа I epsilon (CK1ε) связывает и фосфорилирует mPER1: экспрессированный в одиночку в HEK293 mPER1 преимущественно ядерный, а ко-экспрессия CK1ε маскирует его сигнал ядерной локализации (NLS) и вызывает фосфорилирование-зависимую цитоплазматическую ретенцию, задерживая ядерный вход [10848614].

Стабильность PER2 в HEK293 измеряют люминометрией слияний PER2-luciferase. В этой системе многосайтовое фосфорилирование CK1δ/ε образует «фосфопереключатель»: фосфорилирование дегрона D2 запускает деградацию, тогда как фосфорилирование FASP-домена блокирует CK1 на дегроне и стабилизирует PER2; второй консервативный дегрон D1 играет роль «резерва», а CK1, связанная с димером PER1:PER2, может фосфорилировать D1 у PER1 in trans (скаффолд-опосредованное фосфорилирование) [38777144]. Селективность CK1δ/ε между антагонистическими сайтами (дегрон против FASP) задаётся консервативным анион-связывающим конформационным переключателем активационной петли, напрямую настраивающим стабильность PER2 и период; период-изменяющие мутации CK1 (от человеческой tau до дрозофильных) модулируют этот переключатель — анализы стабильности PER2 велись преимущественно в HEK293 (с Rat-1) [32043967]. Автофосфорилирование CK1δ по регуляторному домену на T347 снижает активность киназы к PER2 (мутант T347A более активен и сильнее деградирует PER2), что картировано сенсибилизированным репортёром PER2::LUC в HEK293 и показывает, что внешние (CDK/пролин-направленные) сигналы могут вклиниваться в контроль CK1δ-PER2 [28545154].

Важно, что генетическая незаменимость CK1 и роль β-TrCP в обороте PER установлены НЕ в HEK293. Совместная незаменимость CK1δ/ε для часов (доминантно-негативная CK1ε отменяет биолюминесцентные ритмы Per2::Luc, а потеря только CK1δ удлиняет период при частичной компенсации) показана в MEF [19948962]. CK1ε-праймированное рекрутирование адаптера убиквитинлигазы β-TrCP, ведущее к 26S-протеасомной деградации PER2 (и удлинение периода при ингибировании CK1ε или протеасомы), — в фибробластах Rat-1 [15767683].

GSK3β/AKT-фосфорилирование позитивных компонентов (BMAL1, Rev-erbα)

GSK3β фосфорилирует BMAL1 конкретно по Ser17 и Thr21 и праймирует его к убиквитилированию/деградации; утрата этого Akt-GSK3β-зависимого фосфорилирования стабилизирует BMAL1, но ДЕМПФИРУЕТ BMAL1-зависимую циркадианную экспрессию (снижает амплитуду) — HEK293 был одной из линий (наряду с MEF и JEG3), в которой ставили анализы фосфорилирования/стабильности и физической ассоциации BMAL1-GSK3β [20049328].

Активируемый инсулином AKT фосфорилирует BMAL1 по Ser42, вызывая диссоциацию BMAL1 от ДНК, связывание 14-3-3 и ядерное исключение, что подавляет трансактивацию CLOCK/BMAL1 — механистическое ядро инсулинового/пищевого ресеттинга периферических часов. Биохимию Akt-опосредованного Ser42-фосфорилирования BMAL1 (ко-ИП Akt2-BMAL1, детекция pSer42, in vitro киназный анализ WT против S42A из лизатов) ставили в HEK293T, тогда как саму субклеточную релокализацию, 14-3-3-связывание и физиологический ресеттинг демонстрировали преимущественно в первичных гепатоцитах и печени мыши [27576939].

Для негативного компонента ситуация обобщённая: GSK3β фосфорилирует и СТАБИЛИЗИРУЕТ Rev-erbα в культивируемых клетках, а литий (ингибитор GSK3) запускает быструю протеасомную деградацию Rev-erbα и, как следствие, активацию Bmal1 — механизм показан в неуточнённых культивируемых клетках как общий, не HEK293-специфичный узел часов [16484495].

Пробелы/неопределённости

• Нет первичного исследования, валидирующего дексаметазон- или форсколин-СИНХРОНИЗАЦИЮ эндогенной циркадианной осцилляции именно в HEK293/HEK293T; такие анализы отработаны на Rat-1, U2OS, NIH3T3 и первичных фибробластах.
• Нет работы, устанавливающей HEK293/HEK293T как надёжный свободнобегущий Bmal1-luc/Per2-luc осцилляторный хозяин; прямые данные, напротив, показывают слабый/демпфированный ритм с неритмичными core-clock-генами за пределами ~28 ч [41746989]. В HEK293 PER2-luciferase применяется как эндпоинт стабильности белка (люминометрия) [38777144; 32043967; 28545154], а не как репортёр самоподдерживающейся осцилляции.
• CK1ε-специфичное (в отличие от CK1δ) генетическое/периодное фенотипирование выполнено главным образом в MEF и Rat-1 [19948962; 15767683], а не количественно в HEK293/HEK293T.
• Нет HEK293/HEK293T-специфичной работы по GSK3/AKT-фосфорилированию самого белка CLOCK (в отличие от BMAL1/Rev-erbα): ко-зависимое фосфорилирование CLOCK показано в MEF [12897057], а GSK3/Rev-erbα — в неуточнённых культивируемых клетках [16484495].
• HEK293/HEK293T многократно служит хозяином ко-трансфекции/ко-ИП и E-box-трансактивации для CLOCK-BMAL1 и репрессии CRY/PER, что отражает его удобство как экспрессионной системы, а не наличие сильных собственных часов.
• Уточнение к [35933018]: исходная формулировка упоминала U2OS среди хозяев, но в самой работе U2OS не использовалась — репортёрные, ко-ИП и стабилизационные анализы велись в HEK293T, а спасение ритма — в Cry1/Cry2 dKO MEF.

Часть II. Взаимодействие часов с метаболическими и сигнальными осями

Циркадные часы и метаболизм опухоли: Варбург, липогенез, NAD+/SIRT1, AMPK

1. Циркадный контроль аэробного гликолиза (эффект Варбурга) в раковых клетках

Наиболее прямое клеточно-линия-специфичное доказательство в целевой линии получено для тройного негативного рака молочной железы MDA-MB-231. Репрессор циркадной петли CRY подавляет гликолитические гены, в первую очередь ключевой "воротный" фермент pyruvate dehydrogenase kinase 1 (PDK1); в модели с геномным редактированием повышение CRY снижает экспрессию Pdk1, накопление лактата и утилизацию глюкозы, а экзогенная экспрессия CRY1 именно в MDA-MB-231 уменьшает потребление глюкозы и скорость роста [38199564]. Это единственная находка, подтверждённая напрямую в поимённо названной раковой линии.

Melatonin как эндогенный циркадный регулятор повышает экспрессию корового гена часов BMAL1, который подавляет метаболизм глюкозы (снижение захвата глюкозы и продукции лактата) в клетках рака молочной железы через впервые описанную ось melatonin-BMAL1-ALDH3A1, что тормозит пролиферацию и рост опухоли; антагонист REV-ERB SR8278 действует синергично с melatonin [41228459]. Важно: конкретная клеточная линия в реферате не названа, поэтому результат нельзя приписать ни MCF7, ни MDA-MB-231.

В немелкоклеточном раке лёгкого (NSCLC) BMAL1 выступает драйвером резистентности к cisplatin: он повышает экспрессию помпы оттока MRP1 через HIF-1α-зависимый гликолиз с усилением продукции лактата; лактат активирует комплекс TAZ/c-Jun/Snail, что ещё сильнее поднимает MRP1, формируя самоподдерживающуюся петлю химиорезистентности, обратимую ингибированием AKT или MRP1 [42029117]. В раке желудка нокдаун корового гена PER2 перепрограммирует гликолиз и метаболизм жирных кислот, вызывая накопление лактата и экспансию иммуносупрессивных M-MDSC (через секрецию VEGF/IL-6 и активацию STAT3), что даёт резистентность к ингибиторам иммунных контрольных точек, снимаемую блокадой метаболизма лактата [41928364]. В плоскоклеточной карциноме полости рта (OSCC) PER3 связывает HIF-1α через домен PAS1 и стимулирует его убиквитинирование/деградацию; низкий уровень PER3 (за счёт гиперметилирования промотора) дерепрессирует HIF-1α, запуская EMT и метастазирование — то есть встраивает часы в HIF-1α-контролируемые гликолитические/гипоксические программы [39733745].

Механистически чистый пример связки BMAL1-HIF-гликолиз получен вне рака, в скелетной мышце мыши: BMAL1 определяет судьбу глюкозы на ранних гликолитических стадиях через нутриент-стрессовый путь HIF; при дефиците Bmal1 гликолиз нарушен и развивается непереносимость глюкозы на диете с высоким содержанием жира, а генетическая стабилизация HIF1α восстанавливает толерантность к глюкозе и экспрессию гликолитических ферментов [40127275]. Обзорный уровень подтверждает обобщение: эндогенные часы оркеструют эффект Варбурга в раковых клетках, MDSC, TAM и фибробластах через множество путей, а циркадная десинхронизация типично проявляется усилением гликолиза с протуморогенными последствиями, что мотивирует время-оптимизированные ингибиторы гликолиза [40772466].

2. Циркадный контроль de novo липогенеза

Прямых данных, связывающих SREBP1/SCD1/FASN/ACC с конкретными генами часов в клеточных линиях колоректального рака или рака молочной железы, среди подтверждённых находок нет. Ближайшие свидетельства — из других моделей. В остеосаркоме человека (линия 143B) siRNA-истощение коровых компонентов часов BMAL1, CLOCK или CRY1/2 (но не стабилизирующих NR1D1/NR1D2/REV-ERB) снижает формирование сфероидов раковых стволовых клеток, миграцию и инвазию, действуя через пути CSC/EMT и биогенез липидных капель со снижением липогенных генов (DGAT1, FASN, ACSL4, PKM2, CHKA, SREBP1) [40214471]. В печёночной модели (MASLD: мыши на MCD-диете + гепатоциты, обработанные пальмитиновой кислотой) стабилизация SIRT1 (GADD45β блокирует его убиквитинирование) повышает фосфорилирование AMPK, что подавляет SREBP1-зависимую транскрипцию липогенных генов SREBP1, FASN и ACC и обращает стеатоз — конкретная ось SIRT1/AMPK/SREBP1, но не в раковой линии [41203689]. На уровне обзора описана карта клеточного контроля над de novo липогенезом в раке: ферменты синтеза жирных кислот SREBP, ACLY, ACC, FASN и SCD регулируются генами часов BMAL1, REV-ERB и DEC и предлагаются как мишени время-таргетированной терапии [38189049].

3. Ось NAD+/SIRT1 и обратная метаболическая связь на часы

Связь клеточного метаболического состояния с ходом часов через NAD+-зависимую деацетилазу SIRT1 установлена прочно, но продемонстрирована в очищенных системах, фибробластах и печени, а не в колоректальных или молочных раковых линиях. SIRT1 циркадно связывает CLOCK-BMAL1 и необходим для высокоамплитудной транскрипции Bmal1, Rorgamma, Per2 и Cry1; он деацетилирует и стимулирует деградацию PER2, сопрягая NAD+/метаболический статус клетки с экспрессией генов часов [18662546]. Параллельно CLOCK обладает гистон-ацетилтрансферазной активностью и ацетилирует гистон H3 и BMAL1 по Lys537; SIRT1 ритмично противодействует этому, деацетилируя BMAL1-K537 и H3 по K9/K14 на циркадных промоторах, работая как метаболит-управляемый (NAD+) реостат активности CLOCK:BMAL1 [18662547].

Сам NAD+ находится под контролем часов. И NAMPT (лимитирующий фермент salvage-пути NAD+), и уровни NAD+ осциллируют под управлением коровых часов: CLOCK:BMAL1 трансактивирует Nampt, тогда как SIRT1, рекрутируемый на промотор Nampt, репрессирует CLOCK:BMAL1 — сцепленная транскрипционно-энзиматическая петля обратной связи, в которой метаболизм NAD+ возвращается на часы [19299583]. Независимая демонстрация на мышиных эмбриональных фибробластах показала 24-часовую осцилляцию внутриклеточного NAD+, прямой драйв циркадной экспрессии Nampt комплексом CLOCK:BMAL1 и рекрутирование SIRT1 на промотор Nampt — то есть часы контролируют синтез собственного кофермента SIRT1 [19286518]. На выходе этой оси клеточные циклы биосинтеза NAD+ управляют ритмичным SIRT3-зависимым деацетилированием митохондриальных окислительных ферментов, порождая ритмы дыхания и продукции ATP; добавление NAD+ восстанавливает митохондриальное деацетилирование и потребление кислорода у мышей с мутацией часов — что привязывает ось часы-NAD+ к окислительному (в противовес гликолитическому) метаболизму [24051248].

Фундаментальное доказательство обратной связи метаболита на позитивное плечо часов: ДНК-связывающая активность гетеродимеров CLOCK:BMAL1 и NPAS2:BMAL1 напрямую регулируется редокс-состоянием кофакторов NAD — восстановленные формы NAD(H)/NADP(H) резко усиливают связывание с ДНК, окисленные — ингибируют (показано в очищенной системе) [11441146].

4. AMPK как энергетический сенсор на негативном плече часов

Нутриент-чувствительная киназа AMPK фосфорилирует и дестабилизирует cryptochrome CRY1; активность и ядерная локализация AMPK ритмичны и обратно коррелируют с ядерным CRY1, так что AMPK транслирует сигналы низкой энергии/нутриентов прямо на негативное плечо часов в периферических тканях [19833968]. Это дополняет ось SIRT1/AMPK/SREBP1 из раздела 2 [41203689] и задаёт общий принцип: энергосенсоры клетки (AMPK, NAD+/SIRT1) входят в петлю часов на нескольких узлах.

5. Heme, REV-ERB и вторичная петля ROR/REV-ERB

Heme обратимо связывается с орфанным ядерным рецептором REV-ERBalpha (негативный компонент часов) и регулирует рекрутирование им корепрессорного комплекса NCoR; heme-REV-ERBalpha подавляет печёночную экспрессию глюконеогенных генов и выход глюкозы, что делает heme метаболит-лигандом, возвращающимся и на часы, и на метаболизм глюкозы [18006707]. Транскрипционный каркас, на котором действует этот лиганд, — REV-ERBalpha как главный регулятор циклической транскрипции Bmal1, обеспечивающий антифазную экспрессию позитивного плеча негативным (петля ROR/REV-ERB) [12150932]. В раковой линии (остеосаркома человека U2OS) изоформ-селективные нокауты NR1D1 (REV-ERBalpha) или NR1D2 (REV-ERBbeta) выявили как избыточные, так и отдельные программы генов-мишеней: REV-ERBalpha преимущественно регулирует сигналинг NF-κB, а REV-ERBbeta поддерживает гены внеклеточного матрикса, что подтверждает heme-лигандируемые REV-ERB как циркадно-метаболические транскрипционные репрессоры в раковой линии [38255844].

6. PGC-1alpha как узел интеграции часов и энергетического метаболизма

Коактиватор PGC-1alpha ритмично экспрессируется и стимулирует гены часов Bmal1 и Rev-erbalpha через коактивацию семейства ROR; клетки/мыши с нокаутом PGC-1alpha имеют нарушенные часы и энергетический метаболизм, что ставит PGC-1alpha в позицию узла, сопрягающего часы с митохондриальным окислительным/энергетическим метаболизмом [17476214].

7. Микроокружение опухоли (не метаболизм ядра клетки)

Отдельно от метаболических осей: циркадная десинхронизация в правостороннем колоректальном раке (высокие CRD-скоры) сопряжена с появлением NONO-положительной субпопуляции опухолевых клеток, становящейся гиперэффективным приёмником протуморогенных сигналов от миофибробластных CAF; NONO действует как двойной циркадный регулятор и протуморогенный сигнальный хаб — то есть механизм касается кросстока опухоль-фибробласт, а не корового метаболизма [41174721]. Обзор циркадного контроля над "hallmarks" рака молочной железы каталогизирует дисрегуляцию транскрипционно-трансляционной петли обратной связи (BMAL1/CLOCK/PER/CRY) и её связи с метаболизмом, пролиферацией и ответом на терапию — полезен как якорь для рака молочной железы, но на уровне путей, а не разрешён по клеточным линиям [42101677].

Пробелы/неопределённости

• Целевые линии почти не покрыты напрямую. Единственная находка, прямо подтверждённая в поимённо названной целевой раковой линии, — CRY1-PDK1 в MDA-MB-231 (TNBC) [38199564]. Прямых первичных данных по HCT116 (колоректальный рак) и MCF7 о циркадном контроле аэробного гликолиза, GLUT1/LDHA/PKM2/HK2, de novo липогенеза или NAD+/SIRT1 в подтверждённом корпусе нет. Единственная первичная работа по BMAL1 и метаболизму глюкозы в раке молочной железы [41228459] не называет линию в реферате.
• Обратная метаболит-часы связь не проверена в целевых опухолевых линиях. NAD+/NADH-редокс на CLOCK/NPAS2:BMAL1 [11441146], heme на REV-ERBalpha [18006707], NAD+/SIRT1 на BMAL1/PER2 [18662546][18662547][19299583][19286518] установлены в очищенных системах, фибробластах (MEF, U2OS) и печени. Перенос этих петель на HCT116/MCF7/MDA-MB-231 — непроверенная экстраполяция.
• Клеточные линии для NAD+/SIRT3-оси в раке. Ось NAD+-SIRT3-митохондриальное окисление [24051248] и узел PGC-1alpha [17476214] показаны как общая часы-метаболизм интеграция (мышь/фибробласты/печень), не в колоректальных или молочных раковых клетках.
• Липогенез в раке молочной железы / колоректальном раке. Связи часы-липогенез (SREBP1/SCD1/FASN/ACC) исходят из печени/MASLD [41203689], остеосаркомы 143B [40214471] и обзоров [38189049], но не из колоректальных или молочных раковых линий.
• HEK293/HEK293T по метаболит-часовой обратной связи в подтверждённом корпусе отсутствуют.
• Микроокружение vs метаболизм ядра. Находка NONO [41174721] относится к кростоку опухоль-CAF, а не к коровому метаболизму, и её не следует использовать как доказательство метаболического механизма.
• NSCLC/желудок/OSCC — «другие модели». Механизмы BMAL1-лактат-MRP1 [42029117], PER2-MDSC [41928364] и PER3-HIF-1α [39733745] убедительны, но получены вне колоректального/молочного контекста и переносятся на них только по аналогии.

Часы, транскрипция и хроматин

Геномная архитектура: от ритмичного связывания TF к рекрутированию Pol II и ремоделированию хроматина

Ключевая идея о том, что циркадные часы управляют не только связыванием факторов транскрипции, но и рекрутированием РНК-полимеразы II и состоянием хроматина, установлена на геномном масштабе в печени мыши. Интеррогация транскрипционной петли обратной связи выявила стереотипный, зависящий от времени суток порядок событий: связывание CLOCK, BMAL1, PER1/2, CRY1/2, рекрутирование RNAPII, экспрессия РНК и смена состояний хроматина проходят три фазы — «взведённое» (poised) состояние, координированную de novo активацию транскрипции и репрессию; при этом лишь ~22% циклирующих мРНК управляются de novo транскрипцией (остальное — пост-транскрипционные механизмы), а циркадная модуляция рекрутирования RNAPII и ремоделирования хроматина охватывает геном гораздо шире, чем это видно по одному профилированию экспрессии [22936566]. ChIP-seq картировал 7 978 сайтов связывания CLOCK в печени мыши и посредством motif-centrality-анализа (MOCCS) показал, что CLOCK связывает не только канонические, но и множество ранее неучтённых неканонических E-box; мотивы CACGNG, CACGTT и CATG(T/C)G валидированы как функциональные в промоторных пробах, определено 1 629 прямых генов-мишеней CLOCK, тогда как значительная часть ритмичных генов не имеет сайтов CLOCK и регулируется косвенно — через clock-зависимые транскрипционные факторы (в т.ч. KLFs) и ритмичные микроРНК [24591654]. Авторитетный обзор синтезирует эти геномные данные в единую рамку: CLOCK:BMAL1 действует как pioneer-подобный активатор, который ритмично реорганизует хроматин и рекрутирует RNAPII и коактиваторы, а глобальная циркадная регуляция затрагивает занятость TF, рекрутирование и инициацию Pol II, нарождающуюся транскрипцию и ремоделирование хроматина [27990019].

Важное ограничение: весь геномный уровень (цистром CLOCK:BMAL1, профили Pol II и гистоновых меток) получен на печени мыши [22936566][24591654]. Аналогичного полногеномного clock-цистрома/Pol II-датасета ни в одной из целевых линий (HCT116, MDA-MB-231, MCF7, HEK293) в верифицированных источниках нет.

CLOCK как гистонацетилтрансфераза и ось HAT ↔ HDAC (SIRT1/NAD⁺)

Сам CLOCK является ферментом: он обладает активностью гистонацетилтрансферазы (HAT), разделяя ацетил-CoA-связывающие мотивы с семейством MYST и ферментативную специфичность (гистоны H3/H4) с ACTR; BMAL1 усиливает эту HAT-активность, и она необходима для восстановления циркадной ритмичности и активации clock-генов в Clock-мутантных клетках — то есть ремоделирование хроматина встроено в ядро часового механизма [16678094]. HAT-активность CLOCK ацетилирует не только гистон H3, но и собственного партнёра BMAL1 по Lys537 (событие, необходимое для циркадной функции); этому противостоит NAD⁺-зависимая деацетилаза SIRT1, активность которой сама регулируется циркадно и коррелирует с ритмичным ацетилированием BMAL1 и H3 по Lys9/Lys14 на циркадных промоторах — SIRT1 ассоциирует с CLOCK и рекрутируется в комплекс CLOCK:BMAL1, работая как «энзиматический реостат» часов (баланс HAT ↔ HDAC) [18662547]. Эта ось замкнута метаболической петлёй: внутриклеточный NAD⁺ осциллирует с 24-часовым ритмом, поскольку CLOCK:BMAL1 транскрипционно управляет NAMPT — лимитирующим ферментом спасительного пути синтеза NAD⁺; получаемый ритм NAD⁺ настраивает активность SIRT1, замыкая транскрипционно-энзиматическую обратную связь между метаболизмом и часами [19286518]. Все три работы — общемеханистические (клеточные/мышиные модели, MEF), не относящиеся к целевым линиям.

Гистоновое метилирование: MLL1 / H3K4me3

Контроль хроматина часами выходит за пределы ацетилирования. Триметилирование H3 по Lys4 на циркадных промоторах ритмично и следует тому же фазовому профилю, что и известный ритм ацетилирования H3; метилтрансфераза MLL1 входит в комплекс с CLOCK-BMAL1, способствует его ритмичному рекрутированию на промоторы и необходима для циклического H3K4me3 и высокоамплитудной осцилляции экспрессии clock-генов (примечательно, что MLL1 не взаимодействует с CLOCKΔ19, что объясняет доминантно-негативный фенотип этой мутации) [21113167]. Данные общемеханистические.

REV-ERB / ROR: RORE, NCoR–HDAC3 и энхансерная репрессия

Плечо петли, регулирующее Bmal1/Arntl, задаётся конкуренцией на RORE: все члены семейства REV-ERB (α и β) репрессируют, а все члены ROR (α, β, γ) активируют транскрипцию Bmal1, соревнуясь за один и тот же RORE-элемент, что и определяет фазу и амплитуду этого плеча [16267379]. REV-ERBα реализует две геномно различные функции: часы он контролирует, связываясь напрямую с когнатными RORE-сайтами, где конкурирует с активирующими ROR; метаболические же гены он репрессирует преимущественно косвенно — рекрутируя корепрессор NCoR–HDAC3 к сайтам, куда его «привязывают» тканеспецифичные факторы (напр., HNF6), — тем самым отделяя часовую репрессию от метаболической [26044300]. Рекрутирование HDAC3 на геном само по себе циркадно в печени мыши и пространственно повторяет связывание REV-ERBα; ацетилирование гистонов инверсно ритму занятости HDAC3, а потеря HDAC3 (или REV-ERB) отменяет ритм ацетилирования и нарушает печёночный липидный метаболизм — это прямая ось REV-ERB → HDAC3 → деацетилирование гистонов [21393543]. Механизм репрессии реализуется в том числе на энхансерах: в макрофагах REV-ERB подавляют функции дистальных энхансеров, выбранных lineage-determining факторами, ингибируя энхансер-направленную транскрипцию и продукцию eRNA клеточно-специфичным образом — молекулярная основа линиеспецифичной циркадной репрессии [23728303]. Вся группа REV-ERB/ROR верифицирована как общемеханистическая (гетерологичные репортёры, печень/макрофаги мыши); данных о занятости RORE или конкуренции ROR/REV-ERB непосредственно в HCT116/MDA-MB-231/MCF7/HEK293 не получено.

PARP1 и энтрейнмент по питанию

PARP-1, NAD⁺-зависимая ADP-рибозилтрансфераза, обладает суточно осциллирующей и регулируемой питанием активностью в печени: он связывает и поли(ADP-рибозил)ирует CLOCK в начале световой фазы; это усиливает/сдвигает связывание CLOCK-BMAL1 с ДНК и фазу его взаимодействия с репрессорами PER/CRY, а Parp-1-нокаут нарушает пищевой энтрейнмент периферических часов — так PARP-1 связывает время питания с системой хронометража [20832105]. Данные — мышиные/механистические; связи PARP1 с часами именно в целевых линиях нет.

Фаза репрессии: фосфорилирование ДНК-связывающих доменов CLOCK-BMAL1

Механизм терминации E-box-трансактивации в каждом цикле: фосфорилирование внутри ДНК-связывающих доменов гетеродимера — CLOCK-Ser38/Ser42 и BMAL1-Ser78 — ослабляет связывание комплекса с E-box и обеспечивает PER-зависимое вытеснение (displacement) CLOCK:BMAL1 с ДНК; фосфомиметические мутации отменяют ритм, а нефосфорилируемые укорачивают период [38805270]. Работа общемеханистическая (клетки млекопитающих; целевые линии как биологический объект не исследуются).

Доля clock-controlled генов

Каноническая количественная оценка выхода часов: атлас 12 органов (RNA-seq/микрочипы) показал, что 43% всех белок-кодирующих генов проявляют циркадные ритмы транскрипции где-либо в организме, преимущественно органоспецифично, с пиками экспрессии, сгруппированными в предрассветный и предзакатный «часы пик» [25349387].

Эпигенетическое молчание clock-генов в опухолевых клетках

Наиболее чёткая мишень эпигенетического сайленсинга в опухолях — сам BMAL1/ARNTL. В гематологических опухолях (диффузная B-крупноклеточная лимфома, ОЛЛ, ОМЛ) BMAL1 транскрипционно замолкает из-за гиперметилирования CpG-острова промотора; повторная экспрессия BMAL1 подавляет рост в колониальных пробах и на «голых» мышах, а вызванная метилированием потеря BMAL1 отменяет рекрутирование партнёра CLOCK и ритмичную экспрессию C-MYC, каталазы и p300 [19861541]. Тот же паттерн подтверждается в солидных опухолях: в раке яичника ARNTL эпигенетически замолкает (гиперметилирование, а также репрессивная метка H3K27me3/EZH2), ведёт себя как кандидат-онкосупрессор, а его сверхэкспрессия тормозит рост, повышает химиочувствительность к цисплатину и восстанавливает ритм c-MYC [25175925]; в назофарингеальной карциноме гиперметилирование ARNTL способствует онкогенезу и снижает чувствительность к цисплатину, дерепрессируя транскрипцию CDK5 [30621723].

Для генов PER картина иная — не простое метилирование промотора. В шести линиях рака шейки матки CpG-остров промотора PER1 оставался преимущественно гипометилированным, а экспрессия PER1 была в основном раскоррелирована с метилированием (наиболее экспрессирующая линия C33A оказалась, наоборот, гиперметилированной), что указывает на доминирование доступности транс-факторов у проксимального E-box, а не метилирования [17592726]. В клетках рака желудка (KATO III, NCI-N87) ингибиторы HDAC (бутират натрия, трихостатин A) реиндуцируют онкосупрессорные Per1/Per2: снижают репрессивную H3K9me3 на промоторе Per1 и повышают H3K9ac на промоторе Per2, тогда как 5-азацитидин не менял метилирование CpG Per2 — то есть операционный механизм сайленсинга PER здесь гистон-модификационный, а не ДНК-метилирование [30008892].

Оговорка по целевым линиям: прямого доказательства ДНК-метилирования-зависимого сайленсинга промоторов PER или CRY именно в HCT116/MDA-MB-231/MCF7 в верифицированных источниках нет; сильнее и чище всего метилирование-зависимый сайленсинг доказан для BMAL1/ARNTL и в опухолях иного происхождения (гематологические, яичник, назофаринкс).

Прямые данные в целевых линиях

HCT116 (колоректальный рак). Нокаут/нокдаун коровых clock-генов ARNTL(BMAL1), PER2 или NR1D1(REV-ERBα) в HCT116 (с SW480/SW620) перепрограммирует пролиферацию и инвазию; выявлена двунаправленная связь часов с драйвером метастазирования MACC1 — белок MACC1 циркадно экспрессируется в HCT116 дикого типа, этот ритм теряется при разрушении часов, а MACC1, в свою очередь, влияет на часовой фенотип (обнаружено взаимодействие MACC1–NR1D1) [35884519]. Нокдаун BMAL1 в HCT116 (и SW480) смещает эпителиально-мезенхимальный баланс в сторону эпителиального состояния (рост E-cadherin/CK-20, падение Twist/N-cadherin/виментина), снижая миграцию, инвазию и химиорезистентность — то есть в этом колоректальном контексте BMAL1 про-инвазивен/про-EMT [34065633]. CRY1/CRY2 дерегулированы в колоректальном раке и линиях (CaCo2, HCT116, HT29, SW480), причём эффект восстановления CRY зависит от статуса p53: HCT116 (p53 дикого типа) имеет более высокий уровень CRY и лишь маргинальный апоптотический/пролиферативный ответ на эктопическую экспрессию CRY, тогда как линии с мутантным p53 (HT29, SW480) отвечают robustно; уровни CRY модулируют ответ на 5-фторурацил/оксалиплатин [26768731]. Наконец, в HCT116 (как и в меланоме B16) подавленные часы можно фармакологически «разбудить»: дексаметазон, форсколин или тепловой шок запускают ритмичную экспрессию clock- и клеточно-цикловых генов, сдвигая клетки из S- в G1-фазу и замедляя рост опухоли; при этом ключевой rescue-эксперимент с нокдауном Bmal1, отменяющий противоопухолевый эффект, выполнен в модели B16 (в HCT116 показан аналогичный эффект дексаметазона) [28196531].

MCF7 и MDA-MB-231 (рак молочной железы). С помощью люциферазных репортёров BMAL1/PER2 показано, что самоподдерживающиеся циркадные осцилляции BMAL1 и PER2 сохраняются в низкозлокачественных люминальных A клетках MCF7, но отсутствуют в высокозлокачественных базальных MDA-MB-231 — прямое свидетельство прогрессирующей утраты часового выхода с ростом агрессивности [31357909]. CRISPR-нокаут BMAL1 в MDA-MB-231 (и нетуморогенных MCF10A) даёт противоположные онкологические эффекты: сенсибилизирует к апоптозу от ДНК-повреждающих агентов (цисплатин, доксорубицин), но одновременно усиливает инвазивность MDA-MB-231 [30375470]; RNA-seq KO- vs WT-MDA-MB-231 показывает, что потеря BMAL1 повышает экспрессию EMT-генов даже в необработанных клетках, а химиосенсибилизация идёт через сеть, центрированную на GSK3β, NACC1 и EGFR [33111200]. В MCF-7 CLOCK работает как негистоновая ацетилтрансфераза: ацетилирует NF-κB p65 по Lys56, потенцируя NF-κB-зависимую транскрипцию PD-L1 и иммунное ускользание; нокдаун CLOCK (sh-CLOCK) в MCF-7 подавляет сигналинг NF-κB/TNF/MAPK и PD-L1 — прямое проявление HAT-активности CLOCK в именованной опухолевой линии [41261416]. В тройном-негативном раке (MDA-MB-231 vs тройной-позитивная BT-474) коровые белки CLOCK, BMAL1, PER1 экспрессированы ниже и регулируются ферментом синтеза мелатонина ASMT: нокдаун ASMT снижает уровни clock-белков и уменьшает миграцию/инвазию MDA-MB-231, а сверхэкспрессия CLOCK этот эффект отменяет [33194597].

HEK293/HEK293T. Ни одного прямого биологического findings (циркадно-онкологического или хроматинового) с HEK293 как объектом исследования в верифицированных источниках не получено. В литературе HEK293(T) фигурирует лишь как гетерологичный хозяин для трансфекционных проб (E-box-люциферазная трансактивация CLOCK:BMAL1, тесты взаимодействия и PER-зависимого вытеснения комплекса с ДНК [38805270]), но не как биологический объект — поэтому направленного HEK293-специфичного утверждения сделать нельзя.

Пробелы/неопределённости

• Геномный уровень только на мыши. Весь цистром CLOCK:BMAL1, профили RNAPII и гистоновых меток верифицированы на печени мыши [22936566][24591654]; полногеномного clock-цистрома/Pol II-датасета в HCT116, MDA-MB-231, MCF7 или HEK293 нет.
• HEK293 — нет прямых данных. Только как трансфекционный хозяин, не объект исследования.
• ДНК-метилирование PER/CRY в целевых линиях не доказано. Метилирование-зависимый сайленсинг чист и силён для BMAL1/ARNTL в опухолях иного происхождения [19861541][25175925][30621723]; для PER данные показывают раскорреляцию с метилированием [17592726] и гистон-модификационный (H3K9me3/H3K9ac), а не ДНК-метилирующий контроль [30008892]. Метилирование PER/CRY в MCF7/MDA-MB-231 не установлено.
• PARP1- и HDAC-часовой crosstalk верифицирован только на механистическом/мышином уровне [20832105][21393543][18662547]; привязки к конкретной HDAC/PARP1 внутри целевых линий нет.
• RORE-регуляция ROR/REV-ERB верифицирована как общемеханистическая (гетерологичные репортёры/печень мыши) [16267379][26044300]; прямых данных занятости RORE или конкуренции ROR/REV-ERB в четырёх линиях нет.
• Отдельные детали шире абстракта. Конкретные активирующие метки H3K4me3/H3K9ac/H3K27ac в [22936566] и H3K27ac-механизм в [23728303] относятся к телу статей, а не к абстрактам (абстракты подтверждают «ремоделирование хроматина»/eRNA-репрессию); rescue-нокдаун Bmal1 в [28196531] выполнен в B16, а не в HCT116. Эти формулировки в тексте даны консервативно.

Перекрёстная регуляция циркадных часов и HIF-1α: механизмы

1. Молекулярная основа: общие партнёры bHLH-PAS и конкуренция за ARNT/BMAL1

И ядро часов (CLOCK, NPAS2, BMAL1/BMAL2), и система кислородного сенсинга (HIF1α, HIF2α, ARNT/HIF1β) относятся к семейству факторов транскрипции bHLH-PAS, которое делится на индуцируемые стимулами белки класса I и более убиквитарные партнёры класса II, образующие с ними гетеродимеры для связывания ДНК; селективность выбора партнёра и функциональная избыточность внутри этого семейства и составляют структурную основу пересечения циркадного и гипоксического путей [35695677]. Раннее прямое свидетельство разделяемого партнёрства получено на белке MOP9 (гомологе CYCLE и MOP3/BMAL1), который образует транскрипционно активные гетеродимеры одновременно с циркадным CLOCK (а также MOP4) и с гипоксическим HIF1α, и коэкспрессируется с CLOCK в супрахиазматическом ядре [10864977]. Классическая догма о рестриктивной димеризации (BMAL1/BMAL2 — только с CLOCK/NPAS2; ARNT — со всеми факторами класса I, кроме CLOCK/NPAS2) в новейшем обзоре признана логически несостоятельной: имеющиеся данные поддерживают неканоническую гетеродимеризацию как HIF1α, так и HIF2α непосредственно с BMAL1 — прямой структурный механизм конкуренции за общего партнёра и интеграции двух сигналов [41362097]. Функциональное подтверждение конвергенции на общих цис-элементах дано на нейробластомных клетках Neuro-2A: HIF-1α и CLOCK кооперативно активируют промотор вазопрессина через критический E-box A (−191/−128), однако gel-shift показывает, что кооперативность реализуется через связывание MOP3(BMAL1), а не через прямой гетеродимер HIF-1α/CLOCK [12691740].

2. Реципрокная регуляция на уровне генома и промоторов (BMAL1/CRY ⇄ HIF1α)

Наиболее полное биохимическое доказательство двунаправленности получено в скелетных миотубах и фибробластах мыши: генетическая инактивация активатора часов BMAL1 повышает уровень белка HIF1α в гипоксии, но при этом Bmal1⁻/⁻ миотубы демонстрируют сниженный анаэробный гликолиз, митохондриальное дыхание на гликолитическом субстрате и сниженную транскрипцию мишеней HIF1α — Phd3, Vegfa, Mct4, Pk-m (PKM) и Ldha; напротив, потеря репрессоров CRY1/2 стабилизирует HIF1α в ответ на гипоксию. В обратном направлении HIF1α напрямую связывается с промоторами ключевых генов часов и при коэкспрессии с BMAL1 трансактивирует репортёры PER2-LUC и HRE-LUC, а стабилизация HIF1α в Vhl⁻/⁻ клетках изменяет циркадную транскрипцию [27773696]. На геномном уровне ChIP-seq HIF1A и BMAL1 выявил их пересекающееся связывание, показав, что интактные часы «гейтируют» (тонко настраивают по времени суток) физиологический гипоксический ответ in vivo [27773697]. Прямое промотор-специфичное подтверждение получено в первичных хондроцитах: стабилизированный HIF1α (через DMOG или кислородный ритм) непосредственно связывает HRE-подобные и E-box-подобные элементы промотора Per2, повышая амплитуду его осцилляций и перезапуская «затухшие» часы; siRNA против HIF1α эту перезагрузку отменяет [36162153]. В бычьих эпителиальных клетках молочной железы MAC-T лактат ингибирует активность PHD и стабилизирует HIF1α, усиливая его связывание с BMAL1 (co-IP) и подавляя индукцию ядерных компонентов часов — эффект авторы объясняют сходством цис-элементов HRE и E-box (конкурентная оккупация); нокдаун HIF1α меняет экспрессию циркадных генов [40307878].

3. Кислород и гипоксия как Zeitgeber: фазовый сдвиг часов через HIF1α

Ритмические колебания кислорода — самостоятельный сигнал синхронизации периферических часов, действующий именно через HIF1α: измеренные in vivo суточные ритмы оксигенации тканей, воспроизведённые в физиологическом диапазоне, синхронизируют клеточные часы HIF1α-зависимо, ряд генов часов реагирует на изменения кислорода через HIF1α, а короткая умеренная гипоксия ускоряет реадаптацию к новому времени (модель джетлага) у мышей дикого типа, но не у HIF1α-дефицитных [27773695]. Встречно гипоксический сигнал сам искажает ход часов: он замедляет циркадный цикл (удлиняет период) и дозозависимо демпфирует амплитуду осцилляций, причём дефекты циркадного ритма усугубляют исходы острой гипоксии (например, при инфаркте) [27773697].

4. Метаболический контур: ось BMAL1–HIF в скелетной мышце

BMAL1 скелетной мышцы необходим для сдерживания HIF-пути in vivo: при диет-индуцированном ожирении мышце-специфичный нокаут Bmal1 нарушает ранние этапы гликолиза и ухудшает толерантность к глюкозе, а генетическая стабилизация HIF1α на фоне дефицита Bmal1 восстанавливает толерантность к глюкозе и нормализует 217 из 736 дисрегулированных генов, включая гликолитические ферменты, — что определяет BMAL1–HIF как ко-регуляторную ось гликолитических генов [40127275]. Вместе с [27773696] это формирует согласованную (но пока преимущественно мышиную) картину ко-регуляции VEGFA и гликолитических генов (LDHA, MCT4, PKM) часами и HIF.

5. Опухолевый контекст (гипоксия → часы → злокачественность)

В раке молочной железы гипоксия деградирует часовой белок PER2 и разбирает его корепрессорный комплекс, рекрутирующий EZH2/SUZ12/HDAC2 к сайтам OCT1 (POU2F1) на промоторах TWIST1 и SLUG; потеря PER2 дерепрессирует гены EMT — TWIST1, SLUG, SNAIL — усиливая инвазию, а понижение PER2 клинически коррелирует с гипоксией и плохим прогнозом рака молочной железы [23836662]. Это единственная в наборе работа с прямым мехистическим доказательством в поимённо названных человеческих линиях рака молочной железы (первичная линия MDA-MB-231, подтверждено также в MCF-7 — обе присутствуют в полном тексте) [23836662]. С опухолевой гипоксией смыкается и представление о «циклической» (перемежающейся) гипоксии: часть генов-мишеней HIF-1, встроенных в некогерентные петли прямой связи (IFFL — HIF-1 активирует мишень напрямую и одновременно активирует противонаправленный фактор), даёт осцилляция-специфичный ответ более экстремальный, чем нормоксия или стабильная гипоксия (продемонстрированы IFFL HIF-1 с p53 и Notch1, связанные с прогрессией рака молочной железы) — контур, релевантный тому, как ритмическая активность HIF-1 декодируется иначе, чем постоянная [41285961]. В раке толстой кишки часы манипулированы напрямую в линии HCT116 (нокауты ARNTL(BMAL1)/PER2/NR1D1 отменяют ритмику сплайсосомных факторов — SF3A1 при BMAL1-KO, HNRNPC при PER2-KO — и вызывают KO-специфичный дифференциальный альтернативный сплайсинг генов-холлмарков рака), однако кросс-ток с HIF1α в этой работе не исследовался [35552415]. На уровне ткани правосторонний колоректальный рак несёт достоверно более высокие показатели циркадной десинхронизации (CRD), чем левосторонний, а возникающая при этом NONO-положительная субпопуляция опухолевых клеток перепрограммирует кросс-ток опухоль–фибробласты в микроокружении (HIF1α напрямую не измеряли) [41174721].

6. Клинические и обзорные данные

В периферической крови пациентов с сахарным диабетом 2 типа (состояние хронической тканевой гипоксии с повышенными лактатом и пируватом) экспрессия HIF-1α парадоксально снижена (blunted), и одновременно достоверно снижена экспрессия практически всех генов часов (PER1/2/3, ARNTL, CLOCK, CRY1/2, RORA) — то есть наблюдается скоординированная понижающая дисрегуляция обеих систем [32823749]. Важная поправка к исходной формулировке находки: по абстракту корреляция между HIF-1α и генами часов положительная, а отрицательно с уровнем HbA1c коррелируют и HIF-1α, и гены часов (клок-гены независимо предсказывают экспрессию HIF-1α); утверждение о «отрицательной ассоциации генов часов с HIF-1α» абстрактом не поддерживается [32823749]. Три обзора очерчивают ту же ось в разных тканях: эволюционно консервативная сеть PER2⇄HIF1A как мишень при ишемии миокарда [31096895]; трёхслойный кросс-ток HIF-1α и BMAL1 (реципрокная регуляция экспрессии, белок-белковое взаимодействие, общие нижележащие пути) в гипоксическом микроокружении регенерации кости [41690951]; и динамическое взаимодействие HIF-1α с ядром часов в физиологически гипоксичных хондроцитах при хондрогенезе и остеоартрозе [38534356].

Пробелы/неопределённости

• Конкуренция за ARNT/HIF1β между BMAL1 и HIF1α прямо (титрование сверхэкспрессией/co-IP) в поимённо названной человеческой линии (HEK293, HCT116, MDA-MB-231, MCF-7) не показана; общий-партнёрский механизм подкреплён лишь гетерологичными/непухолевыми системами (MOP9 в клетках мозга, Neuro-2A) и обзорами/перспективой [41362097; 10864977; 12691740; 35695677].
• HCT116: часы манипулированы (BMAL1/PER2/NR1D1-KO), но прямого исследования кросс-тока HIF1α⇄часы, ритмики HIF1α или ARNT-конкуренции в этой линии нет [35552415].
• MCF-7 фигурирует только как вторичная линия в исследовании PER2/EMT/гипоксия [23836662]; специализированного мехистического исследования кросс-тока BMAL1/CLOCK–HIF1α в MCF-7 в наборе нет.
• Прямое измерение 24-часовой осцилляции эндогенного белка HIF1α в названной человеческой опухолевой линии в наборе отсутствует; ритмика/контроль стабильности HIF1α часами документированы в мышиных тканях/фибробластах и хондроцитах [27773696; 36162153], но не в HCT116/MDA-MB-231/MCF-7.
• Ко-регуляция VEGFA и гликолитических генов (LDHA/MCT4/PKM) часами + HIF установлена в мышиных миотубах/мышце [27773696; 40127275], но не показана напрямую в опухолево-гипоксических моделях HCT116/MDA-MB-231/MCF-7.
• Часть цитируемого — обзоры/нарративы [31096895; 41690951; 38534356; 35695677] и вычислительная модель [41285961]; их следует трактовать как синтез/гипотезы, а не как первичное экспериментальное доказательство.

Циркадианные часы и p53: модуль PER2–p53–MDM2 и его следствия

1. Ядро механизма: PER2 стабилизирует p53, физически перехватывая MDM2

Центральное звено взаимодействия часов и p53 — прямой белок-белковый контакт. Human PER2 (hPer2) связывает C-концевую половину human p53 и образует стабильный тройной комплекс с негативным регулятором p53 — MDM2; связывание PER2 не даёт MDM2 убиквитинировать p53 и направлять его в протеасому, так что базовый пул p53 сохраняется [25103245]. Дозозависимость подтверждена в обе стороны: нокдаун PER2 снижает уровень p53, тогда как сверхэкспрессия PER2 повышает и стабильность белка p53, и транскрипцию его генов-мишеней [25103245]. Важна ограниченность экспериментальной базы: эндогенный комплекс и картирование связывания получены в панели линий из оригинальной работы Gotoh 2014 — колоректальная карцинома HCT116, эмбриональная почка HEK293 и CHO, а связывание PER2/p53 картировано в p53-нулевых H1299 (детали панели — в полнотекстовой версии, PMC4230596) [25103245]. Иными словами, биохимия узла заякорена в HCT116 и p53-null H1299 плюс нетрансформированные HEK293/CHO, а не в широком спектре опухолевых линий.

2. PER2 «воротирует» транскрипционный ответ p53 на генотоксический стресс

Стабилизация p53 через PER2 не эквивалентна его активации — напротив, связанный p53 транскрипционно сдержан. В HCT116 (p53 дикого типа, p53+/+) и H1299 (p53-null) репортёр промотора p21(WAF1/CIP1) — канонической мишени p53 — оставался неактивным в клетках со стабилизированным комплексом hPer2/p53 даже после γ-облучения, поскольку трансактивировать гены ответа на повреждение ДНК способен только свободный от PER2 p53 [25411341]. PER2 действует специфически на узле p53: компоненты контрольной точки выше p53 при повреждении ДНК оставались активными [25411341]. Таким образом, секвестрация p53 периодовым белком работает как переключатель, сдерживающий индукцию мишеней p53 и притупляющий генотоксический ответ; воротирующий эффект показан именно в HCT116(p53+/+)/H1299, то есть в тех же колоректальной и p53-нулевой моделях.

3. Компартментализация и парадокс фазы: PER2 импортирует p53 в ядро

Комбинированное модельно-экспериментальное исследование добавило пространственный слой. PER2 ассоциирует не только с немодифицированным p53, но и с различными убиквитинированными формами p53 и способствует его ядерному импорту; период полужизни ядерного p53 примерно в 7 раз больше, чем цитоплазматического, эктопический PER2 сдвигает p53 в ядро, а нокдаун PER2 этот транспорт снижает [27834218]. Это разрешает кажущийся парадокс: осцилляции PER2 и p53 значимо противофазны, что объясняется тем, что PER2 стабилизирует и переносит p53 в более защищённый ядерный компартмент, а не тем, что их пики должны совпадать [27834218].

4. Реципрокная ветвь: MDM2 деградирует свободный PER2 фосфо-независимо

Связь между часами и p53 двусторонняя и на уровне MDM2. MDM2 — ранее неохарактеризованная E3-убиквитинлигаза для PER2, направляющая PER2 на деградацию фосфорилирование-НЕЗАВИСИМЫМ образом, в отличие от канонического фосфодегронного пути через β-TrCP [30425162]. MDM2-опосредованный оборот PER2 задаёт длину циркадианного периода в клетках млекопитающих, напрямую связывая часто дерегулированный в раке онкобелок MDM2 с работой часов [30425162]. Это зеркальное плечо модуля: PER2 защищает p53 от MDM2, тогда как не связанный с p53 PER2 сам становится субстратом MDM2.

5. Системно-биологический синтез и математическая динамика узла

Обзорно-модельная работа собирает узел в единую схему: в непокоящихся (нестрессированных) клетках PER2 и p53 образуют цитозольный комплекс, а вместе с MDM2 — тройной комплекс в ядре; ассоциация PER2 с C-концом p53 предотвращает и MDM2-опосредованное убиквитилирование/деградацию p53, и транскрипционную активацию p53, а не связанный с p53 PER2 деградируется MDM2 фосфо-независимо [32372973]. Формальная динамика узла подкреплена математической моделью сети p53–Per2 в клетках с повреждённой ДНК, воспроизводящей градуальный переход «нестрессированная клетка → репарация ДНК → апоптоз» по мере роста повреждения [39058613]. Модель предсказывает раздельные ручки управления: усиление ингибирования Per2 со стороны p53 сдвигает фазу осцилляций Per2 вперёд, тогда как настройка ингибирования Mdm2 со стороны Per2 независимо модулирует АМПЛИТУДУ активного p53 (диапазон растёт с силой ингибирования); задержки транскрипции/трансляции/ядерной транслокации порождают устойчивые осцилляции через суперкритическую бифуркацию Хопфа, поддерживающую функцию часов и репаративную ёмкость [39058613]. Оба источника — синтетический/теоретический уровень, а не новые клеточные данные по именованным линиям.

6. Обратное направление: p53 репрессирует Per2 на промоторе и настраивает часы

Противоположная стрелка — p53 как регулятор часов — задокументирована на уровне промотора и поведения. p53 прямо связывает эволюционно консервативный респонсивный элемент в промоторе Per2, который ПЕРЕКРЫВАЕТ E-box, необходимый для связывания BMAL1/CLOCK; тем самым p53 блокирует посадку BMAL1/CLOCK и репрессирует транскрипцию Per2 [24051492]. В супрахиазматическом ядре (SCN) экспрессия p53 и его связывание с промотором Per2 сами находятся под циркадианным контролем; экспрессия Per2 меняется при дефиците p53 или при стабилизации p53 Nutlin-3 (ингибитор MDM2), а p53−/− мыши демонстрируют короткий нестабильный свободнотекущий период и нарушенное фотоувлечение [24051492]. Это и есть базовый механизм p53-зависимой репрессии CLOCK/BMAL1-управляемой транскрипции — но он заякорен в мышином SCN и поведении мыши, а не воспроизведён как ChIP-механизм в человеческих опухолевых линиях.

7. Per2 как опухолевый супрессор in vivo и часовой контроль DDR-генов

In vivo базис задаёт классическая работа Fu 2002: мыши с мутантным mPer2 склонны к опухолям и после γ-облучения показывают заметно повышенное опухолеобразование и СНИЖЕННЫЙ апоптоз в тимоцитах [12372299]. Ядровые гены часов индуцируются γ-облучением у дикого типа, но не у mPer2-мутантов, а временнáя (ритмическая) экспрессия генов клеточного цикла и супрессии опухолей — Cyclin D1, Cyclin A, Mdm-2 и Gadd45alpha — дерегулирована у мутанта, причём c-myc напрямую контролируется циркадианными регуляторами и дерепрессирован [12372299]. Отсюда два вывода для узла: Per2 работает как in vivo опухолевый супрессор, воротирующий ответ на повреждение ДНК, и Mdm2 попадает под часовой/временнóй контроль — но именно на уровне мышиной temporal-экспрессии, а не как прямая демонстрация циркадианной ритмичности белка MDM2 в человеческих клетках.

8. Подтверждения в опухолевых клетках человека и связь с химиорезистентностью

Клеточно-опухолевая (человеческая) поддержка оси PER2→p53/p21 получена в гепатоцеллюлярной карциноме. В клетках PLC/PRF/5 нокдаун (siRNA) или нокаут (CRISPR) PER2 — а также цитоплазматическая мислокализация PER2 в эверолимус- и сорафениб-резистентных сублиниях — снижали белок p53 и p21 и повышали c-MYC и MDM2, что сопровождалось EMT (снижение E-cadherin, рост vimentin/ZEB1) и приобретённой лекарственной резистентностью [40521302]. Абстракт прямо подтверждает падение p53 и общий паттерн «онкогены вверх / супрессоры вниз»; конкретные направления по p21/MDM2/c-MYC получены вестерн-блотами полного текста и согласуются с механизмом PER2→стабилизация-p53 [40521302]. Отдельная линия доказательств связывает потерю Per2 с DDR-фенотипом химиорезистентности: онкоген-трансформированные (H-rasV12 + SV40-LT) эмбриональные фибробласты Per2m/m мышей — склонных к спонтанным и радиационно-индуцированным опухолям — резистентны к ДНК-повреждающим цитостатикам (метотрексат, гемцитабин, этопозид, винкристин, оксалиплатин), потому что белок ALDH3A1 повышен ~в 7 раз и подавляет индуцируемые химиотерапией ROS; shRNA-нокдаун Aldh3a1 восстанавливает чувствительность [30429219].

9. Честный контр-нюанс: p53→miR-34a→часы может быть p53-независимым

Не всякая связь p53 с часами «чистая». В колоректальных линиях DLD1 (p53-мутант) и LoVo (p53-дикий тип) регулируемая p53 опухоль-супрессорная микроРНК miR-34a сильно ингибирует per2 в обеих линиях и bmal1 в LoVo (и rev-erbα в DLD1), очерчивая ось p53→miR-34a→гены часов [37831728]. Однако авторы показали, что влияние miR-34a на гены часов в значительной мере НЕ зависит от статуса p53, а её онкостатический эффект идёт через SIRT1/Cyclin D1, а не через выход часов [37831728]. Это важная оговорка против упрощённого сопряжения «p53→часы» в этих именованных CRC-линиях.

10. Обобщающая логика: PER2 как циркадианный скаффолд опухоль-супрессорных комплексов

Модуль PER2:p53:MDM2 — частный случай более общей роли PER2 как каркаса, собирающего опухоль-супрессорные/транскрипционные комплексы для временнóго воротирования промоторов. В недавней работе PER2 нуклеирует тройной комплекс с опухолевым супрессором BRCA1 и транскрипционным фактором POU2F1/OCT-1 (BRCA1 стабилизирует рекрутирование PER2 к ДНК-связанному OCT-1), а осцилляция мишени Esr1 теряется у Per1/2 двойных нокаутов [42325866]. Это тот же скаффолд-принцип, что лежит под комплексом PER2:p53:MDM2, хотя конкретный комплекс здесь основан на BRCA1, а не на p53 [42325866]. На уровне транскрипционных факторов часов эта рамка поддержана обзором: дисфункция ядровых компонентов CLOCK и BMAL1 в опухолях дерегулирует нижестоящие мишени с многомерными эффектами, включая контроль клеточного цикла и ответ на повреждение ДНК, а CLOCK проявляет и неканонические онкогенные функции через гистон-ацетилтрансферазную активность и циркадиан-независимую модуляцию раковых путей — что мотивирует хронотерапию [41116204].

Специфичность по линиям (сводка)

• Биохимия узла PER2–p53–MDM2 (Gotoh/Finkielstein): HCT116, HEK293, CHO, H1299 [25103245]; DDR-воротирование p21 — HCT116(p53+/+)/H1299 [25411341].
• Компартментализация/фаза — общеклеточный/модельный уровень [27834218].
• MDM2→PER2 деградация — общий (клетки млекопитающих) [30425162].
• p53→Per2-промотор/E-box и поведение — мышиный SCN и мышь [24051492].
• Опухолевая супрессия и часовой контроль DDR-генов in vivo — mPer2-мутантная мышь [12372299].
• Человеческое опухолевое подтверждение оси PER2→p53/p21 — HCC PLC/PRF/5 [40521302]; химиорезистентность через ALDH3A1 — Per2-мутантные MEF [30429219].
• Обобщающий скаффолд PER2:BRCA1:OCT-1 [42325866] и обзор CLOCK/BMAL1 в раке [41116204].

Пробелы/неопределённости

• Молочная железа: ни одно первичное исследование не тестирует комплекс PER2–p53–MDM2 или механизм p53↔BMAL1/CLOCK на промоторе Per2 в линиях MDA-MB-231 или MCF7 — найденные «часы-рак» работы по молочной железе обзорные/общие и этой конкретной оси не касаются.
• Изогенный HCT116: не найдено полногеномного циркадианного/часового профиля или сравнения ритмичности MDM2 в изогенной паре HCT116 p53+/+ vs p53−/−; HCT116(p53+/+) используется лишь для детекции комплекса PER2/p53/MDM2 [25103245] и p21-репортёра/DDR-воротирования против p53-null H1299 [25411341].
• Ритмичность белка MDM2 в опухолевых клетках человека напрямую не показана; свидетельства часового/временнóго контроля MDM2 косвенные — мышиная temporal-дерегуляция Mdm-2 у mPer2-мутантов [12372299] плюс роль MDM2→PER2 как E3-лигазы [30425162].
• p53-репрессия BMAL1/CLOCK-транскрипции доказана в мышином SCN/поведении мыши [24051492] и не воспроизведена как явный ChIP-механизм в именованных человеческих опухолевых линиях (HCT116/MCF7/MDA-MB-231).
• HEK293 несёт данные по комплексу PER2-p53-MDM2 [25103245], но это нетрансформированная эмбрионально-почечная линия; апоптоз p53-мишеней или воротирование контрольной точки в HEK293 не измерялись.
• Фазовая (time-of-day) зависимость p53-управляемого апоптоза vs ареста контрольной точки в четырёх именованных линиях количественно не показана; апоптотическое/чекпойнт-следствие продемонстрировано in vivo (тимоциты mPer2-мутантов [12372299]) и моделированием [39058613], но не фаза-разрешёнными анализами в HCT116/MCF7/MDA-MB-231/HEK293.
• miR-34a-нюанс: в DLD1/LoVo влияние miR-34a на гены часов в значительной мере p53-статус-независимо, а онкостаз идёт через SIRT1/Cyclin D1, а не через выход часов [37831728] — предостережение против чистой трактовки «p53→часы».

Часы и каскад RAS/RAF/MEK/ERK (MAPK): двунаправленный кросс-ток

MAPK-каскад как входной (entraining) сигнал периферического осциллятора

Устойчивая активация каскада MEK/ERK сама по себе достаточна, чтобы запустить и «перевести» периферический осциллятор: обработка фибробластов NIH-3T3 форболовым эфиром (TPA) индуцирует циркадную осцилляцию экспрессии генов, и этот эффект блокируется ингибитором MEK, что определяет MAPK-каскад как entraining-вход клеточных часов вне SCN [10733524]. Это ключевое, но модель-общее наблюдение получено на фибробластах NIH-3T3, а не на опухолевых линиях, интересующих настоящий обзор.

ERK/MAPK фосфорилирует компоненты обеих петель молекулярного осциллятора

MAPK замыкает отрицательную обратную связь на позитивное плечо часов, действуя непосредственно на BMAL1. ERK/MAPK физически ассоциирует с BMAL1 и фосфорилирует его по Ser527, Thr534 и Ser599 in vitro; экспрессия конститутивно активной формы MEK подавляет BMAL1:CLOCK-зависимую трансактивацию с E-box, а мутация BMAL1 по Thr534 (равно как и коэкспрессия киназно-мёртвого MAPK) снимает это подавление — то есть Thr534 является критическим фосфоакцептором отрицательной регуляции [11687575]. Важно, что эта работа выполнена именно в клетках HEK293 — одной из линий, входящих в круг интереса, — что делает её единственным прямым, в названной линии, доказательством фосфо-регуляции корового белка часов со стороны MAPK.

Параллельно ERK/MAPK действует и на репрессоры отрицательного плеча. MAPK ассоциирует с криптохромами и фосфорилирует mCRY1 по Ser247, а mCRY2 — по Ser265 и Ser557; фосфомиметическая замена по консервативному остатку (Ser247 в mCRY1 / Ser265 в mCRY2, но не Ser557) ослабляет способность CRY ингибировать BMAL1:CLOCK-зависимую транскрипцию, то есть MAPK ослабляет CRY-репрессию [15298678]. Эти данные модель-общие (in vitro/мышиные системы), а не привязаны к опухолевым линиям.

Выше по каскаду MAPKKK-киназы семейства ASK (ASK1/2/3) передают осмотический и редокс-стресс на осциллятор: ASK фосфорилирует CLOCK по Thr843/Ser845 и задаёт период и фазу культивируемых клеток, при этом сама TTFL управляет ритмической экспрессией генов Ask (реципрокная связь), а тройной нокаут Ask1/2/3 у мышей ослабляет световые реакции периода и фазы поведенческих ритмов [29555767]. Это также механизм-общее доказательство, полученное в культуре клеток и на мышах, а не в конкретных раковых линиях.

ERK-эффекторы в световой синхронизации SCN

В центральном пейсмейкере (SCN) световая синхронизация реализуется через ось PACAP → ERK/MAPK → нижестоящие киназы. Фотическая стимуляция активирует MSK1 путём фосфорилирования по Ser360 (эффект блокируется ингибитором MEK U0126), активированные ERK и MSK1 колокализуются в ядрах нейронов SCN, а MSK1 сопрягается с индукцией mPeriod1 через CREB-зависимый механизм [15930378]. Функциональная необходимость MSK1 подтверждена на нокауте: у мышей MSK1(-/-) удлинён свободнотекущий период, ослаблен световой фазовый сдвиг-задержка, замедлена реадаптация в парадигме «джетлага» и снижены индуцируемые светом фосфорилирование CREB, фосфорилирование гистонов и экспрессия Period1 [23127194].

Другой ERK-эффектор, p90 рибосомная S6-киназа (RSK1/2/3), также опосредует ход и синхронизацию часов SCN: при фотической стимуляции RSK диссоциирует от ERK и транслоцируется в ядро, а селективный ингибитор RSK SL0101 уменьшает световую фазовую задержку (≈45 мин) и удлиняет циркадный период (≈40 мин) в срезах per1-Venus [36796752]. Наконец, ERK-скаффолд PEA-15 ритмически экспрессируется в SCN, связан с ERK и диссоциирует при световом фосфорилировании, регулируя ERK/MAPK-зависимую активацию гена Period1 — то есть выступает как контролируемый часами модулятор MAPK-сигналинга, замыкающийся обратно на индукцию клок-генов [29383758]. Вся эта группа доказательств получена в нейрональном/SCN-контексте; прямых данных о том, что RSK или MSK синхронизируют периферические часы в клетках толстой кишки или молочной железы, здесь нет.

Онкогенный RAS дерегулирует часы

Одного онкогена RAS достаточно, чтобы дерегулировать часы млекопитающих. В индуцибельной системе гиперэкспрессия RAS нарушает осциллятор и удлиняет циркадный период, тогда как ингибирование RAS его укорачивает; при этом среди линий колоректального рака и рака кожи выделяются «сильные» и «слабые» осцилляторы, различаемые генной сигнатурой, связывающей коровые часы с путём RAS/MAPK, а моделирование указывает на нарушение BMAL1-опосредованной транскрипции как на медиатор фенотипа [24875049]. Локус Ink4a/Arf выступает мостиком между часами и клеточным циклом, модулируя активность RAS: возмущение RAS по-разному сдвигает фазу коровых клок-генов в MEF дикого типа и в Ink4a/Arf-KO, что коррелирует с противоположными решениями о судьбе клетки; BMAL1 тонко настраивает эти RAS-зависимые решения, а дисрегуляция часов усиливает RAS-опосредованную пролиферацию (её рост в Ink4a/Arf-KO) — то есть часы работают как опухолевый супрессор [29216180]. Оба исследования используют индуцибельный RAS в неуточнённых колоректальных/кожных линиях и в MEF, а не в конкретных линиях интереса.

Базальный тонус Ras/Erk также нужен для гомеостаза печёночных часов: совместная гепатоцит-специфичная делеция Shp2/Ptpn11 и Ikkβ (повышающая, соответственно, сигналинг Ras/Erk и NF-κB) нарушает циркадный ритм и провоцирует гепатоцеллюлярную карциному, а человеческие HCC с дисрегуляцией клок-генов демонстрируют сниженный сигналинг Ras/Erk и NF-κB и худший прогноз [34810213]. Обзорно и in vivo показано, что конститутивно активный нейрональный V12-H-Ras (трансгенные synRas-мыши) модулирует сигналинг ERK1/2–CREB и экспрессию GSK3-β в SCN, изменяя фотосинхронизацию и подстраивая длину периода — прямое (по формулировке обзора) свидетельство, что активность Ras задаёт параметры часов через ERK-плечо [28649228] (обзорная статья).

Дисрегуляция часов и RAS/KRAS-управляемая опухоль

Хроническое циркадное нарушение ускоряет KRAS-управляемый онкогенез: хронический «джетлаг» увеличивает опухолевую нагрузку в мышиной модели KRAS-рака лёгкого за счёт нарушения ритмического ядерного трафика HSF1 и накопления HSF1 в ядре с усилением экспрессии его генов-мишеней; фармакологическое или генетическое ингибирование HSF1 снижает рост KRAS-мутантных человеческих клеток рака лёгкого [36170373]. В клетках колоректального рака HCT116 (одна из линий интереса) нокаут отдельных коровых генов часов (ARNTL/BMAL1, NR1D1/REV-ERBα, PER2) приводит к потере ритмичности сплайсосомного гена U2AF1 и KO-специфичному дифференциальному альтернативному сплайсингу генов-холлмарков рака — FGFR2 (IIIb/IIIc) при ARNTL-KO, CD44 при NR1D1-KO и MET при PER2-KO, — что коррелирует с сигналингом эпителиально-мезенхимального перехода [35552415]. Существенно, что это исследование в HCT116 сфокусировано на сплайсинге, а не на связке RAS-амплитуда/период.

В тройном негативном раке молочной железы BMAL1 работает как контекст-зависимый метаболический супрессор: на in vitro-модели TNBC при хронической инсулиновой обработке BMAL1 подавляет гибкость использования митохондриальных субстратов и пируват-зависимое дыхание, а его потеря даёт клеткам метаболические и провоспалительные преимущества и ассоциирована с более высоким риском метастазирования (супрессорная функция проявляется именно в ожирелом/гиперинсулинемическом контексте, но не у худых животных) [32058954]. Восстановление амплитуды часов ограничивает онкогенный фенотип клеток молочной железы: усилитель часов нобилетин возвращает ритмичность аритмичной линии MDA-MB-231 и заметно снижает 2D-подвижность и якорь-независимый рост, тогда как в слабо-ритмичной MCF7 и робастно-ритмичной U2OS эффекты слабы — то есть анти-онкогенный эффект положительно коррелирует с амплитудой часов [32706791]. Эти данные о молочной железе (MDA-MB-231, MCF7 — линии интереса) касаются метаболизма, миграции и амплитуды, но не измеряют ось RAS/ERK-пролиферации напрямую.

Обобщающий синтез

Обзорный синтез описывает отношения MAPK↔часы как двунаправленные: пути MAPK служат входами синхронизации SCN, физически и/или генетически взаимодействуют с компонентами корового осциллятора, влияя на цикличность, и сами обнаруживают циркадные ритмы активации во многих тканях, координируя суточную экспрессию генов; этим объясняется, почему дисрегуляция MAPK и дефекты часов дают перекрывающиеся болезненные фенотипы [24262095].

Пробелы/неопределённости

• Фосфо-регуляция коровых белков часов со стороны ERK/MAPK доказана механистически (BMAL1 — в HEK293 [11687575]; CRY1/CRY2 — [15298678]; CLOCK через ASK — [29555767]), но подтверждена «в названной линии» только для HEK293; аналогичного прямого доказательства внутри HCT116, MDA-MB-231 или MCF7 в верифицированном наборе нет.
• Не найдено работы, которая напрямую манипулирует онкогенным KRAS (например, аллелем G13D, нативным для HCT116) и измеряет амплитуду/период коровых часов именно в HCT116: связь RAS→дерегуляция часов опирается на индуцибельный RAS в неуточнённых линиях и MEF [24875049; 29216180], тогда как клок-работа в HCT116 сфокусирована на альтернативном сплайсинге [35552415].
• Нет BRAF-специфичного (V600E) исследования, связывающего сигналинг BRAF с амплитудой/периодом часов в интересующих линиях; уровень RAF растворён в RAS/Erk-пути [34810213], а не выделен для BRAF.
• Нет прямой проверки того, что нокдаун часов (BMAL1/PER2/CRY) модулирует RAS/ERK-зависимую пролиферацию в MDA-MB-231 или MCF7 с MAPK как измеряемым медиатором; данные по раку молочной железы [32058954; 32706791] касаются метаболизма/миграции/амплитуды, но не оси RAS/ERK-пролиферации.
• Доказательства RSK/MSK/ERK-синхронизации почти целиком получены в SCN/нейрональном контексте [15930378; 23127194; 36796752; 29383758]; прямых свидетельств синхронизации периферических часов в колоректальных или молочно-железистых (опухолевых) клетках через RSK/MSK не найдено.
• Формулировка PMID 24875049 в исходном черновике упоминает «меланому»; в реферате указан «рак кожи» без уточнения гистотипа, поэтому в тексте использован термин «рак кожи». PMID 28649228 и 24262095 — обзорные статьи (не первичные исследования).

Часы и ось PI3K/PIP3/AKT/mTOR: crosstalk с молекулярными часами

Общая рамка: двунаправленная связь

Взаимодействие между сигнальным путём PI3K/AKT и центральным осциллятором носит взаимный характер. Обзорная литература документирует, что различные классы PI3K и изоформы AKT регулируют компоненты ядра часов как на транскрипционном, так и на функциональном уровне, тогда как сами белки часов реципрокно навязывают ритмический паттерн активности PI3K и AKT — как в нормальной физиологии, так и при инициации и прогрессии опухолей [38336976]. Параллельный контур выстроен вокруг mTOR: активность mTOR (mTORC1/mTORC2) сама находится под циркадианным контролем и робастно осциллирует в многих системах, а сигнализация mTOR, в свою очередь, задаёт фундаментальные свойства центральных и периферических часов, включая длину периода [36045116]. Важно, что бо́льшая часть механистических данных получена на общих клеточных/тканевых моделях (фибробласты, гепатоциты, SCN, печень), на модельных организмах (Drosophila, goldfish) либо в обзорах; лишь единичные работы привязывают этот crosstalk к поимённо названным линиям рака человека (см. ниже).

GSK3β как центральный узел, переводящий тонус PI3K/AKT на белки часов

Наиболее плотно проработанная точка сопряжения — GSK3β, киназа ниже по течению от PI3K/AKT (AKT инактивирует GSK3β фосфорилированием). GSK3β действует на белки часов направленно и противоположно в зависимости от того, активатор это или репрессор — логику суммирует обзор: фосфорилирование по GSK3β инактивирует и направляет к деградации позитивные активаторы BMAL1 и CLOCK, но активирует и способствует ядерной транслокации репрессивных белков PER и REV-ERBα, тогда как CRY, по-видимому, вовлечён в тонкую настройку; этот узел также сцеплен с программой Nrf2/долголетия [33941065].

• BMAL1. GSK3β фосфорилирует BMAL1 специфически по Ser17 и Thr21, «прайминг» для убиквитилирования и деградации; в отсутствие GSK3β-опосредованного фосфорилирования BMAL1 стабилизируется, но, парадоксально, BMAL1-зависимая экспрессия генов часов при этом ослабляется, а амплитуда осцилляций падает — то есть сама стабилизация не эквивалентна усилению функции [20049328]. Эта работа прямо помещает событие в контекст оси Akt–GSK3β [20049328].
• PER2. GSK3β (гомолог Drosophila shaggy) физически взаимодействует с PER2 и фосфорилирует его, способствуя ядерной транслокации; ингибирование GSK3β литием задерживает фазу экспрессии генов часов, а сверхэкспрессия GSK3β фазу опережает [15972822].
• CRY2. В печени GSK3β последовательно фосфорилирует CRY2 по Ser553 (после «праймингового» фосфорилирования по Ser557), запуская протеасомную деградацию; при этом активность самого GSK3β осциллирует, достигая пика от поздней ночи к раннему утру, что вписывает оборот CRY2 в фазу цикла [15980066].
• REV-ERBα. GSK3β фосфорилирует и стабилизирует REV-ERBα (негативный компонент, репрессор Bmal1); ингибирование GSK3 литием ведёт к быстрой протеасомной деградации REV-ERBα и активации транскрипции Bmal1, выделяя стабильность REV-ERBα как ключевой узел, связывающий сигнализацию GSK3/PI3K с часами [16484495].

На уровне поведенческого водителя ритма ту же ось подтверждают данные Drosophila: повышенная активность AKT или TOR-S6K удлиняет циркадианный период, а сниженный AKT его укорачивает, причём эффект TOR-S6K опосредован SGG/GSK3β, действующим на ядерное накопление белка часов TIMELESS, — прямая связка «нутриент/PI3K-AKT-TOR → скорость часов» [20619819].

Ветвь mTOR/S6K1: период, амплитуда и трансляционное сопряжение

mTOR задаёт внутренние свойства осциллятора. Ингибирование mTOR удлиняет период и гасит амплитуду в моделях гепатоцитарных и адипоцитарных часов, тогда как активация mTOR укорачивает период и увеличивает амплитуду; конститутивная активация mTOR в фибробластах Tsc2−/− повышает уровни коровых белков часов CRY1, BMAL1 и CLOCK [29750810]. Механистическое сопряжение mTOR с часами на уровне трансляции обеспечивает S6K1: эффекторная киназа mTORC1 S6K1 ритмически фосфорилирует BMAL1 по эволюционно консервативному сайту, и это фосфорилирование необходимо, чтобы BMAL1 ассоциировался с трансляционной машинерией и стимулировал синтез белка — то есть BMAL1 выступает фактором трансляции, сцепляющим путь mTOR с циркадианной осцилляцией белкового синтеза [25981667].

Инсулин/IGF-1 как входной сигнал через PI3K/PIP3 и mTOR

Гормоны насыщения замыкают внешний вход часов на ту же ось. Инсулин и IGF-1 перенастраивают циркадианные часы in vivo и in vitro, индуцируя синтез белков PERIOD; для этой индукции требуются одновременная активация mTOR, усиление фосфоинозитидной (PI3K/PIP3) сигнализации и понижение микроРНК, а нарушенная по времени инсулиновая сигнализация дезорганизует поведенческие и генно-часовые ритмы [31030999]. Прямое доказательство участия именно PI3K/AKT дают эксперименты на печени goldfish: инсулин повышает содержание транскриптов per1a и per2, а фармакологическое ингибирование пути PI3K/AKT (но не MEK/ERK) предотвращает эту индукцию [37569272].

Онкологический контекст: где ось сцепляется с ростом, выживанием и лекарственным ответом

• HCT116 (толстая кишка, PIK3CA-мутантная, дикий тип p53) — прямые данные в названной линии. Нокдаун BMAL1 усиливает активацию пути AKT/mTOR; в фоне дикого типа p53 сначала возникает p53-зависимая волна апоптоза, а затем выжившие клетки демонстрируют сниженный p53, но повышенную активность AKT/mTOR и усиленную пролиферацию — то есть потеря часов «отпускает» AKT/mTOR-зависимый рост [32388500]. Это единственная из отобранных работ, тестирующая связку «часы ↔ AKT/mTOR-выживание» непосредственно в HCT116.
• REV-ERBα в опухолях — функциональная инверсия на программы PI3K-Akt/MAPK. В опухолях REV-ERBα функционально инвертируется из корепрессора в сильный транскрипционный активатор (переключение с комплекса NCoR/HDAC3 на коактиваторы BRD4/p300) и прямо активирует тысячи туморогенных генов, включая программы PI3K-Akt и MAPK (факторы роста, RTK, RAS, AKT, MAPK), действуя совместно с пионерным фактором FOXA1; SR8278 в комбинации с ингибитором BRD4 подавляет эту программу и рост опухоли [39383000]. Модель — множественные опухолевые линии, поимённые присвоения в абстракте не детализированы.
• Тройной негативный рак молочной железы (TNBC), in vitro, гиперинсулинемия. При хроническом воздействии инсулина BMAL1 подавляет инсулин-индуцированную гибкость митохондриального субстрата и пируват-зависимое дыхание и действует как онкосупрессор именно в контексте ожирения/гиперинсулинемии; понижение BMAL1 ассоциировано с повышенным риском метастазирования в опухолях молочной железы человека [32058954]. Линия в абстракте не названа, а механизм — метаболический (инсулин/митохондрии); отнесение к «PI3K-контексту» здесь интерпретативно (инсулин сигналит через PI3K), прямого измерения PI3K/AKT в этой работе нет.
• MCF7 — прямые данные в названной линии, но через NF-κB/MAPK, а не PI3K/AKT. Сверхэкспрессия CLOCK усиливает пролиферацию и придаёт устойчивость к доксорубицину и гемцитабину; нокдаун CLOCK (sh-CLOCK) в MCF-7 подавляет сигнализацию NF-κB, TNF и MAPK и экспрессию PD-L1, а CLOCK управляет ацетилированием NF-κB p65 (K56), способствуя иммунному ускользанию [41261416]. Связь идёт через NF-κB/MAPK, а не через PI3K/AKT — важная оговорка для позиционирования этой работы в PIP3-нарративе.
• Рак яичника (EOC) — прямая связка PI3K → CRY1 с терапевтическим следствием. Антиангиогенные агенты (бевацизумаб, цедираниб) подавляют CRY1, ингибируя путь VEGF/VEGFR/PI3K; поскольку CRY1 поддерживает транскрипцию генов гомологичной рекомбинации (HR), PI3K-зависимое подавление CRY1 снижает активность HR и сенсибилизирует HR-компетентные клетки к PARP-ингибитору олапарибу [38420012].
• Панель молочной железы — статус часов как детерминанта лекарственной чувствительности. Глубокое циркадианное фенотипирование 14 моделей рака молочной железы выделяет четыре фенотипа часов (функциональный, слабый, нестабильный, дисфункциональный) и показывает, что сила/стабильность часов критически формирует ответ на противоопухолевые препараты [39994450]. Индивидуальные присвоения линий (в т.ч. распространённых MCF7 и MDA-MB-231) в абстракте не итемизированы.

Подтверждающий не-онкологический контур: тонус PI3K/AKT нужен для ритмичности Bmal1

Отдельно уместно отметить работу вне онкологии, прямо демонстрирующую необходимость тонуса PI3K/AKT для поддержания осцилляции часов: хроническая инфекция Porphyromonas gingivalis снижает гиппокампальный фосфо-AKT (p-AKT) и уплощает осцилляцию Bmal1; в глиальных клетках блокада PI3K воспроизводит потерю ритма Bmal1, тогда как агонист AKT восстанавливает ритмы Bmal1 и подавляет активацию глии/IL-1β [42271186]. Это укрепляет причинность «PI3K/AKT-тонус → ритмичность Bmal1» на независимой ткани.

Пробелы/неопределённости

• HEK293/HEK293T. Среди отобранных работ нет ни одного первичного исследования, использующего HEK293(T) для характеристики PI3K/AKT/mTOR/GSK3β-фосфорилирования корового белка часов; в корпусе HEK293 фигурирует лишь как генерический экспрессионный хозяин, но не в PI3K–часы-механистическом исследовании.
• PTEN и PIP3-фосфатазный узел. Ни одна первичная работа не связывает потерю PTEN / PTEN-нулевой статус с регуляцией белков часов ни в MDA-MB-231, ни в какой-либо иной названной линии; «PTEN-null как PIP3-часы-контекст» присутствует только в обзорной рамке [38336976], но не в первичных данных — это подлинный пробел доказательной базы.
• PDK1 (PDPK1). PDK1 не связан с фосфорилированием или регуляцией какого-либо конкретного белка часов ни в одной отобранной работе; шаг PIP3→PDK1→AKT в отношении BMAL1/CLOCK/PER выводится из данных по AKT/GSK3β [20049328; 20619819], но не продемонстрирован на самом узле PDK1.
• Прямой сайт AKT на CLOCK или PER2 в названной линии рака человека. Ни одна первичная работа не показывает прямой сайт фосфорилирования AKT на CLOCK или PER2 в поимённой линии рака человека; связь AKT→часы маршрутизирована через GSK3β (BMAL1 Ser17/Thr21 [20049328]; PER2 [15972822]; CRY2 [15980066]) либо через mTOR/S6K1 (BMAL1 [25981667]).
• MDA-MB-231 конкретно. Для MDA-MB-231 нет отобранной работы, связывающей её состояние PI3K/AKT со стабильностью или ядерным входом белков часов; ближайшее TNBC-свидетельство [32058954] линию не называет и метаболично по механизму.
• PIK3CA-мутантная HCT116 как модель «часы vs AKT-выживание». Поддержана единственным исследованием нокдауна BMAL1 [32388500]; ни одна отобранная работа не тестирует в HCT116, спасает ли фармакологическое ингибирование PI3K/AKT/mTOR амплитуду часов или, реципрокно, меняет ли манипуляция часами PIK3CA-зависимое выживание сверх этого единичного отчёта.
• GSK3β → деградация CLOCK. Деградация партнёра BMAL1 — CLOCK — по GSK3β утверждается в обзорах [33941065], но первичной работы именно по GSK3β-опосредованной деградации CLOCK в этих поисках не всплыло, в отличие от хорошо задокументированных действий GSK3β на BMAL1, PER2, CRY2 и REV-ERBα.

Часы, MYC и метаболические партнёры

MYC/N-MYC как репрессор молекулярных часов: ось REV-ERBα↑ → BMAL1↓ и конкуренция за E-box

Центральное экспериментальное ядро темы — прямая репрессия молекулярных часов онкогенами семейства MYC. Показано, что дерегулированная экспрессия MYC или N-MYC разрушает часы in vitro, напрямую индуцируя REV-ERBα (NR1D1), что подавляет экспрессию и осцилляцию BMAL1 (ARNTL); эффект снимается нокдауном REV-ERB [26387865]. Механистическая гипотеза опирается на то, что MYC связывает геном через E-box-мотивы (5'-CACGTG-3'), идентичные сайтам связывания гетеродимера CLOCK-BMAL1, — то есть MYC и ядро часов делят одни и те же регуляторные площадки [26387865]. В том же исследовании эктопический MYC глубоко изменяет осцилляцию метаболизма глюкозы и нарушает глутаминолиз, а на клиническом уровне высокий REV-ERBα предсказывает плохой исход N-MYC-управляемых нейробластом со сниженным BMAL1, тогда как реэкспрессия BMAL1 в линиях нейробластомы подавляет их клоногенность [26387865]. Важно, что эти механистические выводы получены in vitro на моделях нейробластомы (и на стандартных клеточных системах для циркадных исследований), а не на конкретных линиях, названных в исходном запросе (см. «Пробелы»).

Направление «MYC → устойчивая индукция REV-ERBα» дополнительно закреплено рецензируемой корреспонденцией (с ответом авторов, PMID 28332490), само название которой утверждает, что онкогенный MYC персистентно повышает компонент часов REV-ERBα [28332504]. Следует оговорить скептически: эта запись не содержит абстракта, поэтому подтверждается только соответствие направления заявлению по заголовку; более тонкая формулировка о «дебате» между механизмом устойчивой индукции REV-ERBα и прямой конкуренцией за E-box из метаданных как таковых не верифицируется.

Независимая линия доказательств в MYCN-амплифицированной нейробластоме подтверждает и расширяет модель: MYCN напрямую связывает промоторы коровых генов часов, индуцируя репрессоры и снижая активаторы, и в итоге ослабляет часы через подавление экспрессии и осцилляции BMAL1, способствуя выживанию клеток; нарушение часов независимо предсказывает плохой исход [34183658]. Здесь же представлено терапевтически важное «обращение»: восстановление активатора часов RORα (сверхэкспрессия или агонист SR1078) возвращает экспрессию/осцилляцию BMAL1, блокирует MYCN-зависимый рост опухоли и de novo липогенез и сенсибилизирует опухоли к химиотерапии [34183658].

Глобальная потеря осцилляций и статическое усиление биосинтеза

За пределами отдельной оси REV-ERBα/BMAL1 активация MYC приводит к системному коллапсу циркадной программы. Временные ряды RNA-seq и метаболомики на нескольких линиях рака с индуцируемым MYC/N-MYC показали, что MYC нарушает более 85% осциллирующих генов и переводит ранее циркадные биосинтетические программы в статический, неосциллирующий режим повышенной экспрессии: усиление рибосомного и митохондриального биогенеза, подавление путей клеточной адгезии, отмена осцилляции белков-переносчиков нутриентов при резком росте их экспрессии и поверхностной локализации, увеличение внутриклеточных пулов аминокислот и утрата временнóй сегрегации между метаболизмом аминокислот и нуклеотидов [37639465]. Это позиционирует потерю циркадного контроля как способ «высвободить» биосинтез из-под временнóго ограничения — потенциальное преимущество опухолевой клетки [37639465].

Двунаправленность MYC↔часы и конкуренция за E-box (обзорный уровень)

Обзорная литература формализует взаимоотношение как двунаправленное: MYC (и N-MYC/L-MYC) разрушает молекулярные часы, тогда как нарушение часов реципрокно дерегулирует и повышает MYC; MYC и CLOCK-BMAL1 рассматриваются как конкуренты за общие процессы — состояние хроматина, глобальный транскрипционный профиль, метаболическое перепрограммирование и иммунный инфильтрат опухоли, — с предложением использовать ингибирование MYC для восстановления функции часов [34299381]. Молекулярная основа конкуренции за E-box подкрепляется обзором E-box-связывающих транскрипционных факторов (EBTF): MYC как канонический онкоген и другие bHLH/цинк-пальцевые факторы разделяют E-box как регуляторный элемент и, как утверждается, функционально сходятся в онкогенезе, что делает их сетью-мишенью [37601651]. Оговорка: в абстракте этого обзора конкретно CLOCK-BMAL1 и мотив CACGTG не названы — тезис о прямой MYC↔CLOCK-BMAL1 конкуренции за E-box здесь является обоснованной экстраполяцией концепции EBTF, а прямое механистическое доказательство даёт первичная работа [26387865].

Часы и гликолиз (Warburg): единственная прямая привязка к названной линии

Наиболее конкретная привязка «часы → гликолиз» к именованной раковой линии — репрессия «привратника» гликолиза PDK1 криптохромом CRY1. CRY подавляет гликолитические гены, в первую очередь Pdk1, снижая накопление лактата и утилизацию глюкозы; это CRY1-опосредованное снижение PDK1 прямо продемонстрировано в клетках трижды негативного рака молочной железы MDA-MB-231, где экзогенная экспрессия CRY1 уменьшает потребление глюкозы и скорость роста [38199564]. Это — единственная из верифицированных работ с прямыми данными в одной из линий, фигурирующих в запросе (MDA-MB-231), и при этом она реализует ось CRY1→PDK1, а не ось MYC–часы.

На обзорном уровне нарушение циркадных ритмов связывают с проопухолевым усилением гликолиза (эффект Варбурга) в раковых клетках, MDSC, опухоль-ассоциированных макрофагах и фибробластах микроокружения, что мотивирует хронотерапию с таймингом ингибиторов гликолиза [40772466]. Фоновый механизм: ключевые шаги гликолиза находятся под сильным циркадным контролем в высокопролиферативных клетках, включая раковые, полагающиеся на аэробный гликолиз ради быстрого ATP и анаболических субстратов, — отсюда идея хронофармакологического подавления гликолитического перепрограммирования [34948470].

Часы и глутаминолиз/глутамин: контекст-зависимое направление BMAL1

Связь часов с глутаминовым метаболизмом в верифицированной литературе разнонаправленна и зависит от контекста/онкогена. С одной стороны, эктопический MYC нарушает глутаминолиз в раковых клетках [26387865]. С другой — в мышьяк-индуцированной уротелиальной карциноме окислительный стресс вызывает сверхэкспрессию BMAL1 вместе с глутаминазой (GLS) через активацию NQO1 и устойчивый дисбаланс осцилляций NADH, стимулируя глутаминовый анаплероз в клетках SV-HUC-1, T24 и BFTC-905 и в уротелии животных; здесь BMAL1 идёт вверх — противоположно MYC-зависимой потере BMAL1 [39137608]. Отдельная механистическая (неопухолевая, онтогенетическая) модель показывает, что нишевый эндотелиальный BMAL1 гейтирует доступность глутамина для пролиферирующих клеток: доминантно-негативный Bmal1a в эндотелии снижает glud1a (glutamate dehydrogenase), повышая локальный глутамин и стимулируя экспансию гемопоэтических стволовых/прогениторных клеток; ось BMAL1–GLUD1–глутамин консервативна в фетальной печени мыши [41853934]. Итого: направление влияния BMAL1 на глутаминовый метаболизм (про- или антиопухолевое) не унифицировано и зависит от драйвера и ткани.

Молекулярное партнёрство часов и HIF (связь с гипоксическим перепрограммированием)

Мост между часами и гипоксическим/метаболическим перепрограммированием обеспечивается прямым белковым партнёрством BMAL1 с HIF. Структурная первичная работа (крио-ЭМ комплекса BMAL1–HIF2A–DNA) показывает, что коровый фактор часов BMAL1 образует транскрипционно активный неканонический гетеродимер с HIF2A, усиливая транскрипционную активность HIF2A и стабилизируя его белок, — физически связывая циркадный тайминг с сигналингом гипоксии (миокардиальный, неопухолевый контекст) [40269168]. Обзор закрепляет обобщение: и HIF1α, и HIF2α способны гетеродимеризоваться с BMAL1, пересматривая прежнее допущение о строго ограниченной димеризации bHLH-PAS-белков и давая концептуальную рамку для интеграции циркадного и гипоксического сигналинга [41362097]. Прямой демонстрации этой оси именно в опухолях MYC-контекста в верифицированном наборе нет.

Конвергенция MYCN–часы–метаболизм в микроокружении нейробластомы

Обзор позиционирует MYCN как мастер-регулятор метаболизма нейробластомы, прямо перепрограммирующий множество опухоль-внутренних метаболических узлов, и явно утверждает, что эти MYCN-управляемые метаболические контуры дополнительно регулируются организменными и клеточными циркадными часами и диетой хозяина, совместно формируя иммуносупрессивное микроокружение — прямое заявление о конвергенции MYCN–часы–метаболизм [40993020].

Пробелы/неопределённости

• Named-line данные тонкие/отсутствуют. Из четырёх линий, названных в запросе, прямые данные есть только для MDA-MB-231 — и это ось CRY1→PDK1/гликолиз [38199564], а не ось MYC–часы. Для HCT116 (колоректальный рак), MCF7 (ER+ РМЖ) и HEK293 в верифицированном наборе нет ни одной первичной работы, связывающей MYC, часы и метаболизм; коровый механизм MYC→REV-ERBα→BMAL1 установлен на моделях нейробластомы и стандартных циркадных клеточных системах [26387865][34183658].
• NRF2 не сомкнут с MYC–BMAL1. Ни одна верифицированная первичная работа не исследует совместно NRF2 + c-MYC + BMAL1 в названных линиях; пересечение NRF2–MYC–HIF–часы остаётся концептуальным.
• Серин/глицин/одноуглеродный (фолатный) метаболизм не связан с часами через MYC ни в одной из четырёх названных линий в верифицированном наборе.
• REV-ERBα → глутаминолиз — вывод по косвенным данным. Хотя MYC/N-MYC индуцирует REV-ERBα [26387865][28332504] и отдельно нарушает глутаминолиз [26387865], ни одна верифицированная работа не смыкает REV-ERBα напрямую с GLS/глутамином в MYCN-нейробластоме.
• Направленческий конфликт BMAL1 не разрешён. MYC/N-MYC подавляет BMAL1 [26387865][34183658], тогда как при мышьяк-индуцированной уротелиальной карциноме BMAL1 повышен вместе с GLS [39137608]; про- или антиопухолевая роль BMAL1 в глутаминовом метаболизме контекст-зависима.
• Направление «часы → MYC» опирается на препринт без PMID. Тезис, что эндогенный c-MYC сам является циркадным выходом (осциллирует в противофазе к BMAL1/PER2), в верифицированном наборе держится только на нерецензируемом препринте bioRxiv 2026 в U2OS (Europe PMC PMC13232071; PMID отсутствует) и потому исключён из подтверждённых цитирований; в рецензируемой литературе и в названных линиях это пока не подтверждено.

Циркадные часы, клеточный цикл, ответ на повреждение ДНК и химиочувствительность

Ниже синтезированы только верифицированные первичные работы (17/17 PMID разрешились, названия совпали, абстракты подтверждают заявленные механизм и направление эффекта). Материал сгруппирован по механизмам; для каждого утверждения указана строгость доказательства — прямо в названной линии, в иной опухолевой модели или на уровне общего механизма/модели.

1. Часы задают ход клеточного цикла: G1/S и G2/M

Позитивный комплекс CLOCK/BMAL1 контролирует переход G2/M через Cyclin B1: нокдаун Bmal1 или Clock в мышиных фибробластах NIH3T3 с репортёрами часов и фаз цикла снижает уровень Cyclin B1, задерживает G2/M и удлиняет клеточный цикл, что воспроизводится в объединённой вычислительной модели часы+цикл с индукцией Cyclin B1 через BMAL1 [30558467]. Это ключевое звено «часы → CDK1/Cyclin B1 → митоз» показано в фибробластах, а не в опухолевых линиях фокуса.

Со стороны G1/S фармакологическое усиление ритмичности (dexamethasone, forskolin, heat shock) в опухолевых клетках запускает ритмичную экспрессию генов часов и клеточного цикла, сдвигая популяцию из S-фазы в G1 и замедляя пролиферацию; эффект показан в меланоме B16 и в человеческой карциноме толстой кишки HCT-116 [28196531]. Причинность именно через часы доказана нокдауном Bmal1, отменяющим действие dexamethasone на клеточный цикл и рост опухоли, — но этот rescue выполнен в опухолях B16, тогда как HCT-116 продемонстрировала лишь сам сдвиг S→G1 без отдельного BMAL1-нокдауна [28196531]. Аналогичное направление — накопление в G1 при потере genome-maintenance-фактора — получено в человеческих HEK293T: нокдаун нуклеазы репликации/репарации FEN1 нарушает ~30% осциллирующих транскриптов (потеря/появление ритма, сдвиги фазы, изменение амплитуды) с обогащением по путям клеточного цикла, DDR и сенесценции и согласованными фазовыми задержками регуляторов контрольной точки G1/S; фенотипически это снижает вход в S-фазу, накапливает клетки в G1 и повышает маркеры сенесценции [41980678].

На уровне теории связь двух осцилляторов формализована: стохастическое моделирование плюс однокле­точная микроскопия показывают, что установленных генных сетей часов и клеточного цикла достаточно для их сцепления, порождающего линейные (родословные) корреляции времён деления и «терапевтическое окно» между пиками пролиферации опухолевых и нормальных клеток; при этом стабилизатор часов KL001 почти не меняет рост популяции, но сильно изменяет линейные корреляции — то есть сцепление реально даже при внешне неизменной динамике популяции [40241744].

2. Циркадный контроль ответа на повреждение ДНК и репарации (NER/XPA, гомологичная рекомбинация)

Фармакологическое усиление транскрипционного выхода часов ингибированием CRY (KS15) и REV-ERB (SR8278) повышает на уровне мРНК и белка фактор эксцизионной репарации нуклеотидов XPA и регуляторы клеточного цикла Wee1 и p21, ускоряя удаление аддуктов цисплатин-ДНК, увеличивая долю клеток в G1 и защищая от антипролиферативного действия цисплатина [34504274]. В абстракте названы «культивируемые человеческие клетки»; конкретные линии (A549 аденокарцинома лёгкого и кератиноциты HaCaT) следуют из полного текста, а не из абстракта, и это не линии фокуса. Таким образом, ось XPA/NER→чувствительность к цисплатину под контролем модуляторов часов документирована, но вне HCT116/MCF7/MDA-MB-231.

Гомологичная рекомбинация также подчинена часам: в человеческих клетках резекция концов ДНК (коммитирующий шаг HR) осциллирует в течение суток с пиком ранним утром и спадом к концу дня; core-компонент часов CRY1 обеспечивает это, потенцируя анти-резекционную активность CCAR2 для ограничения CtIP к ночи, причём требуется фосфорилирование CRY1 со стороны DNA-PK; эта регуляция влияет на прогрессию опухолей и ответ на лучевую терапию [41326346]. Это доказательство общемеханистическое (человеческие клетки, не привязано к линиям фокуса).

Пересечение часов с p53-сигналингом при повреждении ДНК формализовано количественно: модель сети p53–PER2 в клетках с повреждённой ДНК описывает реципрокное сопряжение p53↔PER2 как драйвер осцилляторной динамики DDR (стадии от неповреждённой клетки к репарации и апоптозу по мере роста повреждения) [39058613]. Это чисто вычислительная работа, без экспериментов в конкретных линиях.

3. BMAL1 как контекст-зависимый модулятор химиочувствительности

Наиболее прямое для линий фокуса свидетельство: shRNA-нокдаун BMAL1 сдвигает эпителиально-мезенхимальный баланс в эпителиальную сторону (рост E-cadherin/EpCAM/CK-20, падение Twist/N-cadherin/vimentin) и снижает миграцию, инвазию и химиорезистентность в первичных колоректальных линиях HCT116 и SW480, тогда как в метастатической SW620 MET-подобный сдвиг выражен слабее — то есть эффект максимален в первичных клетках [34065633]. Здесь направление: потеря BMAL1 → повышение химиочувствительности.

Механистически часы задают и суточную эффективность 5-FU: полногеномный CRISPR-скрининг показывает, что BMAL1 транскрипционно управляет ферментами пиримидинового метаболизма (UPP2, UCK2 и особенно UMPS), связываясь с E-box в промоторе UMPS, так что нарушение этих генов (прежде всего UMPS) сбивает исход лечения 5-FU и поддерживает диурнальную эффективность препарата в клетках CRC [35903686]. В абстракте фигурируют «клеточные линии CRC» без поимённого указания; направление — BMAL1→UMPS/активация 5-FU.

Однако направление эффекта BMAL1 контекст-зависимо. В условиях гипоксии в CRC-клетках работает ось HIF-1α→BMAL1→ALDOC: HIF-1α повышает BMAL1, тот увеличивает гликолитический фермент ALDOC, усиливая гликолиз и снижая апоптоз, что уменьшает чувствительность к оксалиплатину; показано в DLD1 и LoVo с клинической корреляцией HIF-1α/ALDOC [40535800]. Ещё резче противоположное направление в немелкоклеточном раке лёгкого (NSCLC): BMAL1 драйвит резистентность к цисплатину, повышая эффлюксный насос MRP1 через HIF-1α-зависимый гликолиз и лактат, который активирует комплекс TAZ/c-Jun/Snail; реципрокно цисплатин и этопозид индуцируют BMAL1 через AKT, образуя самоусиливающуюся петлю резистентности, обратимую ингибированием AKT или MRP1 [42029117]. Таким образом, «BMAL1 → резистентность» (лёгкое, гипоксический CRC) прямо противоположно «нокдаун BMAL1 → химиочувствительность» в нормоксическом первичном CRC [34065633], что подчёркивает контекст-зависимость и делает опасными обобщения «часы = про/анти-резистентность».

Отдельная опора для роли транскрипционной активности CLOCK/BMAL1 in vivo: на циркадно-мутантных мышах, представляющих противоположные крайности трансактивации CLOCK/BMAL1, функциональный статус комплекса прямо коррелирует с чувствительностью/токсичностью к генотоксическому цитостатику циклофосфамиду (в т.ч. через контроль B-клеточного ответа на активные метаболиты CY), обосновывая часы как модулятор чувствительности к генотоксическому стрессу и рациональ хронохимиотерапии [15917646].

4. PER2, CRY2 и ARNTL2 (BMAL2): другие компоненты часов и лекарственная устойчивость

Потеря ядерного PER2 переводит клетки в агрессивный, устойчивый к системной терапии фенотип: в модели гепатоцеллюлярной карциномы (родительские PLC/PRF/5 и everolimus-/sorafenib-резистентные сублинии, а также siRNA-нокдаун и CRISPR-нокаут) снижение PER2 уменьшает p53 и p21, повышает онкогены (c-Myc, MDM2) и индуцирует EMT (падение E-cadherin, рост vimentin/ZEB1), причём в резистентных клетках PER2 релокализуется из ядра в цитоплазму с колокализацией с CK1ε; EMT-сдвиг и потеря p53 наиболее выражены в everolimus-резистентных, KD и KO вариантах [40521302]. Направление — потеря/цитоплазматическая мислокализация PER2 → резистентность и EMT; линия HCC, не из фокуса.

В раке молочной железы Cryptochrome 2 (CRY2) подавляет пролиферацию, а его репрессируемые мишени обогащены по пути NF-κB; p300-зависимое ацетилирование CRY2 (обратимое HDAC6) ослабляет этот антипролиферативный эффект и де-репрессирует мишени NF-κB — то есть посттрансляционный переключатель инактивирует опухоль-супрессорную функцию часов [37024472]. Это молочная железа как ткань, но без привязки к MCF7/MDA-MB-231 и без прямого измерения химиочувствительности.

Clock-ген ARNTL2 (BMAL2) сверхэкспрессирован в раке толстой кишки и драйвит резистентность к 5-FU, напрямую связываясь с промотором SLC7A11 и повышая его транскрипцию (а также стабилизируя мРНК SLC7A11 через PHGDH), чем подавляет ферроптоз; мелатонин деградирует ARNTL2 по убиквитин-протеасомному пути и восстанавливает чувствительность к 5-FU [40753759]. Направление — ARNTL2↑ → резистентность (анти-ферроптоз); ARNTL2↓/мелатонин → возврат чувствительности. Мехнизм подтверждён абстрактом (in vitro и in vivo модели); конкретные линии (заявленные HCT116 и SW620) в абстракте не названы и опираются на полный текст.

5. Фенотипы часов, хронотерапия и «терапевтическое окно»

Глубокое циркадное фенотипирование панели из 14 линий рака молочной железы выделяет четыре фенотипа часов (functional, weak, unstable, dysfunctional) и показывает, что сила/стабильность часов — детерминанта фармакологического ответа, а конкретные циркадные признаки описательны для чувствительности к противоопухолевым препаратам [39994450]. Люминальная линия MCF7 (наряду с немалигнантной MCF10A и остеосаркомой U-2 OS как бенчмарками) входит в панель по полному тексту, но не названа в абстракте; это единственное появление MCF7 среди верифицированных работ, и оно панельное, а не выделенное механистическое исследование.

Экспериментальный каркас хронотерапии дополняет высокопроизводительное live-imaging глубокое фенотипирование опухолевых моделей, устанавливающее, что время суток введения препарата определяет эффективность: подход профилирует циркадный ритм, рост и лекарственный ответ, выявляя оптимальные окна лечения, отзывчивые комбинации клетка/препарат и клеточно-генетические факторы, формирующие зависимость чувствительности от времени суток [39169017]. Вместе с моделью «терапевтического окна» [40241744] это обосновывает существование оптимальных временных окон, но на уровне общего подхода, а не конкретной пары линия-препарат из фокуса.

Пробелы/неопределённости

• MDA-MB-231: ни одна верифицированная первичная работа не связывает гены часов (BMAL1/PER2/CRY/WEE1/XPA) с гейтингом клеточного цикла, DDR или химиочувствительностью прямо в MDA-MB-231. Это заметное отсутствие, а не подтверждённый результат.
• MCF7: назван только в панельном фенотипировании [39994450] и лишь по полному тексту; выделенного механистического исследования WEE1/XPA/G2-M или конкретного препарата (doxorubicin, paclitaxel) в MCF7 среди верифицированных находок нет.
• XPA/NER→цисплатин/оксалиплатин документирован через модуляторы часов в A549+HaCaT [34504274], но не в HCT116/MCF7/MDA-MB-231.
• Часовой WEE1→CDK1 гейтинг G2/M опирается на мышиные NIH3T3 (Cyclin B1) [30558467] и фармакологию в A549/HaCaT (Wee1) [34504274]; прямой демонстрации в линиях фокуса нет.
• HEK293 представлен только транскриптомикой FEN1-нокдауна в HEK293T [41980678]; исследований химиочувствительности/резистентности в HEK293 не найдено.
• Doxorubicin и paclitaxel в связке «конкретный ген часов × препарат» в MCF7/MDA-MB-231 среди верифицированных первичных работ отсутствуют.
• Специфичность линий: для [40753759] (HCT116/SW620), [39994450] (MCF7/MCF10A/U-2 OS) и [34504274] (A549/HaCaT) идентичность линий не подтверждается абстрактом и держится на полном тексте; сами механизмы абстрактами подтверждены.
• Контекст-зависимость BMAL1 доказана (проти­воположные направления в первичном CRC [34065633] против гипоксического CRC [40535800] и NSCLC [42029117]) — обобщённое утверждение о «прочистовом» или «прорезистентном» эффекте часов неверно без указания ткани и микросреды.
• Работы [39058613] и [40241744] — вычислительные/модельные; [15917646] — in vivo мышиная модель/перспектива; их выводы механистически-общие, а не измерения в линиях фокуса.

Часть III. Углублённые механизмы (заполнение пробелов, выявленных критиком)

CK1δ/ε-фосфорилирование PER1/PER2: канонический механизм установки периода и деградации PER, и разрыв с раковой пролиферацией

Канонический фосфодегрон PER2 и β-TrCP-зависимый протеолиз

Опорный механизм установки периода: CK1ε (CSNK1E) фосфорилирует PER2, создавая фосфодегрон, который рекрутирует адаптер SCF-убиквитинлигазы β-TrCP к специфическому сайту, что запускает деградацию PER2 26S-протеасомой; ингибирование CK1ε замедляет деградацию PER2 и достоверно удлиняет циркадианный период, а доминантно-негативный β-TrCP блокирует фосфорилирование-зависимый оборот PER2 [15767683]. Важно, что эта каноническая биохимия получена в фибробластах Rat-1 (клеточная модель ритма), а не в раковой пролиферативной линии [15767683]. In vivo это подтверждено на knock-in мышах PER2-Ser478Ala, у которых устранение CK1-создаваемого β-TrCP-фосфодегрона по Ser478 удлиняет поведенческий период, вызывает накопление белка PER2 в ядре и цитоплазме при практически неизменном уровне мРНК Per2, и нарушает трёхфазный распад и температурную компенсацию в MEF [32354999].

Фосфопереключатель PER2: стабилизирующее плечо FASP против дестабилизирующего дегрона

CK1δ/ε оказалась искомой прайминг-киназой самого фосфопереключателя PER2: CK1ε и сплайс-вариант CK1δ2 праймируют mPER2 к последующему фосфорилированию эффективнее, чем CK1δ1, и это нижележащее фосфорилирование стабилизирует PER2, задерживает его деградацию и удлиняет период; C-концевой хвост CK1 при этом делает период чувствительным к клеточной сигнализации [29784789]. Стабилизирующее плечо реализуется через продукт-ингибирование: фосфорилированный FASP-серинов кластер PER2 (в CK1-связывающем домене PER1/PER2) напрямую связывает и подавляет CK1δ, стыкуя фосфосерины в консервативные анион-связывающие сайты у активного центра; ограничение FASP-фосфорилирования снижает это ингибирование, уменьшая стабильность PER2 и укорачивая период в человеческих клетках, причём механизм консервативен вплоть до Drosophila PER [37207626]. Выбор между FASP и дегроном определяется конформационным переключателем: консервативный анион-связывающий сайт CK1 управляет конформацией активационной петли и тем, какие сайты PER2 предпочтительно фосфорилируются, задавая стабильность PER2; период-изменяющие мутации CK1 от человека до Drosophila дифференциально модулируют этот переключатель, давая предсказуемые сдвиги стабильности PER2 [32043967]. Стабильность PER2 контролируется двумя дегронами: фосфорилирование дегрона D2 запускает деградацию, тогда как FASP-фосфорилирование блокирует CK1 на дегроне; второй дегрон D1 (консервативный в PER1) играет резервную роль, а CK1, связанная в димере PER1:PER2, способна фосфорилировать PER1 D1 in trans (скаффолд-фосфорилирование) [38777144].

Регуляция активности самой киназы CK1δ

Активность CK1δ к PER2 настраивается фосфорилированием её регуляторного домена: фосфорилирование остатка T347 (киназами, чувствительными к динациклибу/стауроспорину, то есть пролин-направленными) снижает фосфорилирование PER2, а мутант T347A более активен и сильнее промотирует деградацию PER2 — связывая клеточно-циклические/сигнальные входы с контролем часов через CK1δ [28545154]. Параллельно CK1δ автоингибируется автофосфорилированием внутренне неупорядоченного C-концевого хвоста: сплайс-варианты δ1 и δ2 различаются только крайним C-концом (XCT), и δ1-специфичные XCT-фосфосайты обеспечивают более сильное автоингибирование — их мутация повышает киназную активность in vitro и в клетках и меняет период, объясняя изоформ-специфичные эффекты на часы [39356670].

Кинетика tau-мутанта и структурная динамика

Молекулярно-динамическое/Марковское моделирование (валидированное in vitro киназными ассеями) показывает, что дикий тип CK1 предпочитает конформацию активационной петли «loop down», связывающую FASP-мотив (стабилизация PER), тогда как tau-мутант (R178C) предпочитает альтернативную конформацию, ускоряет динамику CK1, ухудшает связывание FASP и смещает активность к фосфодегрону — структурная основа коротко-периодической, PER-дестабилизирующей кинетики tau-мутанта [40968534]. Классическая tau-мутация, идентифицированная в CK1ε хомяка и воссозданная в Drosophila Double-time (DBT), укорачивает период; мутагенез показывает, что tau-остаток лежит в более крупном поверхностном домене (сайт распознавания фосфата / область NLS), нарушение которого даёт короткий период [30769795].

Ядерная доступность CK1δ и динамика комплекса PER:CRY

Доступность CK1δ (основной циркадианной киназы) в ядре ограничена быстрой ядерной деградацией и экспортом несобранной киназы; CK1δ-опосредованное фосфорилирование может нарушать взаимодействие PER2-CRY1, порождая цитоплазматические димеры PER2 с субстехиометрическим CRY1 и способствуя клиренсу ядерного PER2, тогда как CK1δ-зависимое высвобождение CRY1 в ядро поддерживает репрессию CLOCK:BMAL1 — сцепляя CK1δ с динамикой комплекса PER:CRY и периодом [42290481].

PER1 (а не только PER2) как субстрат CK1

Деградация PER1 CK1-зависима в нормальных человеческих фибробластах: ингибиторные исследования показывают, что семейство CKI (CK1ε и CK1δ) фосфорилирует hPER1 и увеличивает его кажущуюся массу; ингибитор CKI-7 нарушает деградацию hPER1, задерживает ядерный вход и продлевает его ядерную персистенцию, а ингибиторы протеасомы блокируют деградацию hPER1 — устанавливая контроль CK1 над стабильностью и локализацией PER1, а не только PER2 [14750904].

Ингибиторы CK1 и раковая пролиферация: механизм часов НЕ мостится к названным линиям

Прямые данные по раку молочной железы принадлежат longdaysin (пуриновому производному, мишенями которого являются CK1δ, CK1α и ERK2): в HEK293T он подавляет Wnt/β-catenin через ингибирование CK1δ/CK1ε (репортёр SuperTOPFlash), а в клетках MDA-MB-231 и Hs578T снижает фосфо-LRP6/DVL2, активный и общий β-catenin и Wnt-мишени (Axin2 и др.), уменьшая колониеобразование, миграцию/инвазию и сфероидообразование, и подавляет рост ксенографта MDA-MB-231 [30787621]. Однако этот эффект маршрутизируется через Wnt/β-catenin, а не через PER-фосфопереключатель, и здесь HEK293T выступает лишь как хост/репортёрная система [30787621]. Единственные CK1-данные в HCT116 используют изоформу CK1α (CSNK1A1): ингибитор D4476 в комбинации с 5-фторурацилом подавляет аутофагический поток (LC3/p62), вызывает арест G1/S/G2, истощает пролиферативные гены cyclin D1 и c-myc и MDR-гены (ABCG2, ABCC3) и сенсибилизирует HCT116 к 5-FU — то есть через аутофагию/Wnt-мишени, а не через δ/ε-механизм деградации PER [34536148].

В остальных раковых моделях та же киназа действует преимущественно вне часового пути. В клетках колоректального рака CK1ε промотирует деградацию AXIN1 через SIAH1-опосредованное убиквитинирование, а генетическое или фармакологическое ингибирование CK1δ/ε повышает AXIN1, снижает Wnt/β-catenin-гены и подавляет жизнеспособность и туморогенез CRC in vitro и in vivo [38419282]. В раке мочевого пузыря CSNK1D повышен, нокдаун CK1δ снижает β-catenin и рост, а ингибиторы CK1δ 13i HCl и PF-670462 подавляют пролиферацию, запускают некроптоз, обращают EMT и уменьшают миграцию — что даёт антипролиферативную активность PF-670462 в модели, не относящейся к колоректальным/молочным линиям [32282334]. В плоскоклеточной карциноме головы и шеи CSNK1D действует как онкогенный драйвер через ось Hedgehog: связывает SHH и PTCH1, стабилизирует комплекс CSNK1D-SHH-PTCH1 и активирует ось GLI1-BCL2, а SB-203580 ингибирует CK1δ [41353440]. В гепатоцеллюлярной карциноме циркадианный ген CSNK1E прогностически информативен и, по функциональным ассеям (CCK8/проточная цитометрия/Transwell/wound-healing с WB/qPCR), способствует пролиферации и миграции через путь Hippo [41014359]. В хроническом лимфолейкозе (модель Eµ-TCL1 и первичные клетки) ингибирование CK1δ/ε подавляет пролиферацию клеточно-автономно (накопление в S/G2) и через микроокружение снижает про-выживательную сигнализацию NF-κB ниже CD40L:CD40, блокируя CD40L-индуцированную пролиферацию (слабее при дефектах TP53) [41939248]. Наконец, CK1ε-PER2-ось напрямую задействована ингибитором PF-670462 вне рака: в STZ-диабетических сердцах крыс и высокоглюкозных кардиомиобластах H9c2 диабет удлиняет период PER и повышает CK1ε и фосфо-PER2, а PF-670462 (или siRNA к PER2) снижает фосфо-PER2 и ослабляет кардиальное повреждение [35227001].

Пробелы/неопределённости

• Ни одно исследование не характеризует CK1δ/ε-фосфорилирование PER1/PER2 (FASP/degron-переключатель или кинетику установки периода) непосредственно в HCT116. Единственные CK1-данные в HCT116 используют изоформу CK1α + 5-FU через аутофагию/MDR, а не δ/ε-механизм деградации часов [34536148] — то есть каноническая CK1-PER-механика в HCT116 не валидирована.
• Нет данных по CK1δ/ε-PER, специфичных для MCF7. Прямые доказательства по раку молочной железы (longdaysin) получены в MDA-MB-231 и Hs578T и маршрутизируются через Wnt/β-catenin, а не через циркадианный PER1/PER2-фосфопереключатель [30787621].
• PF-670462 не тестировался в HCT116, MDA-MB-231 или MCF7; его антипролиферативные данные лежат в раке мочевого пузыря [32282334], ХЛЛ [41939248] и кардиальной модели H9c2 (ось CK1ε-PER2) [35227001], но не в названных колоректальной/молочных линиях.
• Идентификатор «PF-480402» из формулировки темы не подтверждается ни одним верифицированным источником в этом наборе; по всей видимости, это опечатка (вероятно, CK1ε-селективный PF-4800567), и данных о раковой пролиферации под именем PF-480402 нет.
• Каноническая FASP/degron/tau-кинетика CK1-PER установлена практически целиком в системах HEK293(T)/Rat-1/MEF/мышь и Drosophila, а также в человеческих фибробластах [15767683][32354999][37207626][40968534][30769795][14750904]; она не переброшена на пролиферативные фенотипы HCT116 или линий рака молочной железы. Онкологическая CK1-литература и циркадианная CK1-PER-литература остаются двумя во многом раздельными корпусами.
• В раковых пролиферативных линиях CK1δ/ε действует преимущественно через Wnt/β-catenin (AXIN1, LRP6/DVL2) [38419282][30787621], Hedgehog (GLI1-BCL2) [41353440], Hippo [41014359] или NF-κB [41939248] — а не через PER1/PER2-деградационный переключатель. Ни одно исследование напрямую не связывает PER-деградационную/период-задающую активность CK1 с пролиферацией в HCT116, MDA-MB-231 или MCF7.
• HEK293/HEK293T фигурирует только как хост/репортёрная система для часового механизма (Wnt-репортёр SuperTOPFlash в [30787621]; ассеи прайминга/PER2-LUC); нет исследования HEK293, которое сцепляет CK1δ/ε-PER2-фосфорилирование с пролиферативным фенотипом — что согласуется с тем, что HEK293-секция обзора каталогизирует ERK, GSK3β, PPP4 и PCBP1, но опускает CK1.

REV-ERB как фармакологическая мишень в противоопухолевой цитотоксичности: агонисты SR9009/SR9011 против антагониста SR8278

Канонический результат: агонисты REV-ERB летальны для опухолевых клеток (Sulli/Kojetin)

Центральное фармакологическое утверждение восходит к работе Sulli et al. (Nature 2018): два синтетических агониста REV-ERBα (NR1D1) и REV-ERBβ (NR1D2) — SR9009 и SR9011 — специфически летальны для опухолевых и онкоген-индуцированных сенесцентных клеток (включая меланоцитарные невусы) и не влияют на жизнеспособность нормальных клеток и тканей; противоопухолевый эффект затрагивает разные онкогенные драйверы (HRAS, BRAF, PIK3CA и др.), сохраняется в отсутствие p53 и в условиях гипоксии, а регуляция аутофагии и de novo липогенеза этими агонистами играет критическую роль в запуске апоптоза в злокачественных клетках [29320480]. In vivo SR9009/SR9011 подавляют рост глиобластомы и увеличивают выживаемость без выраженной токсичности [29320480].

Важная оговорка для скептического читателя: сам абстракт Nature 2018 не называет конкретные линии HCT116, MCF-7 или T47D и не приводит частных считываний (TUNEL, cleaved caspase-3, WST-1, ко-обработка NAC, shRNA-деплеция REV-ERB, ULK1/ULK3/BECN1/ATG7, p62/SQSTM1, LC3B, FASN/SCD1, линия A172). Абстракт подтверждает лишь обобщённый механизм: селективная летальность, независимость от p53 и гипоксии, апоптоз через ингибирование аутофагии и de novo липогенеза [29320480]. Приписываемая колоректальной линии HCT116 апоптотическая леталность с on-target-подтверждением (shRNA-зависимость REV-ERB), а также разбивка на аутофагическую (MCF-7/T47D) и липогенную (A172) ветви — это детали полного текста той же статьи, а не абстракта. В нижеследующем прозе я отделяю то, что подтверждено абстрактом (обобщённый механизм и профиль селективности), от того, что известно из полного текста.

Механизм 1: блокада аутофагии

Абстракт Nature 2018 прямо называет ингибирование аутофагии одним из двух проксимальных механизмов, через которые агонисты REV-ERB запускают апоптоз в злокачественных клетках [29320480]. По полному тексту этой работы аутофагическая ветвь была продемонстрирована в линиях рака молочной железы MCF-7 и T47D (снижение LC3B-пунктов, накопление субстрата p62/SQSTM1, подавление ULK1/ULK3/BECN1/ATG7 с REV-ERB-мотивами в промоторах и спасение сверхэкспрессией ULK2/ULK3/LKB1); эти линие-специфичные детали не воспроизводятся в абстракте и здесь приводятся как контекст полного текста, а не как самостоятельно подтверждённое абстрактом утверждение [29320480].

Аутофагическая ветвь независимо воспроизведена в других злокачественных моделях, что усиливает её как общий цитотоксический механизм:

• Множественная миелома (RPMI8226, U266): SR9009 подавляет GRP78-зависимую аутофагию, ингибируя ключевые гены ATG5 и BECN1 и конверсию LC3, снижает жизнеспособность/пролиферацию и индуцирует апоптоз; напротив, нокдаун REV-ERBα повышает ATG5 и BECN1. SR9009 синергичен с бортезомибом in vitro и в ксенографтах [38022411].
• Мелкоклеточный рак лёгкого: SR9009 оказывает REV-ERB-зависимый противоопухолевый эффект через ингибирование аутофагии; ключевой ген аутофагии Atg5 идентифицирован как прямая мишень REV-ERBα и репрессируется SR9009; эффект сохраняется в химиорезистентных сублиниях (H69AR, H446DDP) наравне с химиочувствительными H69/H446, in vitro и в подкожных ксенографтах [32292508].

Механизм 2: de novo липогенез (FASN/SCD1)

Второй проксимальный механизм по абстракту Nature 2018 — подавление de novo липогенеза [29320480]. Считывание липогенных ферментов (снижение FASN и SCD1, обеднение пула свободных жирных кислот, частичное спасение олеиновой кислотой — конечным продуктом SCD1) — это детали полного текста; в самой статье количественная оценка FASN/SCD1 была показана в линии глиобластомы A172, а не измерена непосредственно в HCT116. Абстракт подтверждает лишь то, что de novo липогенез является ко-летальным механизмом и что глиобластома — это in vivo-модель эффективности [29320480].

Липогенная ветвь также независимо воспроизведена в множественной миеломе: SR9009 подавляет два незаменимых фермента de novo липогенеза FASN и SCD1, тогда как нокдаун REV-ERBα повышает FASN и SCD1 [38022411]. Таким образом, двухопорный механизм «аутофагия + липогенез» подтверждён в отдельной злокачественности с генетическим (нокдаун REV-ERBα) реверсом.

Расширение агонистического эффекта на другие опухоли

• Глиобластома T98G: SR9009 (REV-ERB-агонист) снижает жизнеспособность T98G с последствиями для клеточного цикла, оказывает цитотоксический эффект (также в HepG2), снижает уровни ROS и повышает липидные капли; авторы делают вывод о цитотоксичности за счёт фармакологической модуляции опухоль-внутреннего часового механизма [31825658]. Это распространяет доказательство «агонист REV-ERB как противоопухолевый препарат» на ЦНС-линию.
• Панель рака молочной железы (более ранняя работа, 2015): агонист SR9011 подавляет пролиферацию ER+, ER−, HER2+, HER2− и трижды-негативных линий независимо от ER/HER2-статуса, без эффекта на нетрансформированные MCF10A; останавливает клеточный цикл до M-фазы и идентифицирует Cyclin A (CCNA2) как прямую мишень REV-ERB; NR1D1 геномно ассоциирован с ERBB2/HER2 [26074263]. Это антипролиферативный (клеточно-цикловой) режим, а не откровенная апоптотическая леталность панели Nature; конкретные линии (MDA-MB-231/MCF-7) в абстракте поимённо не выделены [26074263].

Фармакологические оговорки к «on-target REV-ERB»

Скептический анализ требует отметить, что часть цитотоксичности SR9009/SR8278 не является on-target по REV-ERB:

• Off-target SR9009 (LXRα/FOXM1): в раке предстательной железы SR9009 селективно летален к агрессивному подтипу PCS1 (ингибирует колониеобразование, клеточный цикл, миграцию; индуцирует апоптоз) через блокаду оси LXRα/FOXM1 (снижение FOXM1, CENPA, CENPF, CDK1, CCNB1/2, BIRC5) в ксенографтах 22RV1, но нокдаун/нокаут REV-ERB НЕ спасает эффект — активность опосредована LXRα, а не REV-ERB [36357378]. Любое утверждение о чисто on-target REV-ERB-фармакологии SR9009 должно быть квалифицировано.
• Обратное направление фармакологии (ингибирование REV-ERB тоже противоопухолево): медицинско-химическая кампания показала, что ингибирование REV-ERB усиливает хлорохин-опосредованную гибель опухолевых клеток и дало двойные ингибиторы аутофагии/REV-ERB (лид-соединение 24) с in vitro-цитотоксичностью значительно выше хлорохина по разнообразным опухолевым клеткам и с монотерапевтической эффективностью в ксенографте меланомы [38117953]. Это усложняет простой нарратив «агонист = летален, антагонист = защищает».

Антагонист SR8278: противоопухолевый — но в ином, контекст-зависимом сценарии

• Функциональная инверсия REV-ERBα: когда REV-ERBα переключается из репрессора в BRD4/p300-рекрутирующий транскрипционный активатор (смена партнёров с NCoR/HDAC3), он напрямую запускает онкогенные программы MAPK и PI3K-Akt вместе с пионерным фактором FOXA1; фармакологическое воздействие SR8278 снижает активность REV-ERBα и FOXA1 и синергично с BRD4-ингибитором подавляет онкогенные программы и рост опухоли [39383000]. То есть именно антагонист SR8278, а не агонист, рационален, когда REV-ERBα — онкогенный активатор.
• Пластичность клона в t-NEPC: REV-ERBα выступает мастер-регулятором индуцированной терапией нейроэндокринной пластичности рака простаты; ARSI перепрограммируют REV-ERBα в BRD4/p300-активатор >15 драйверов пластичности (POU3F2/BRN2, ASCL1, FOXA2, ONECUT2, MYCN), а потеря REV-ERBα отменяет эти программы и ингибирует рост NEPC; фармакологическое ингибирование REV-ERBα мощно блокирует рост опухолей NEPC, включая PDX [41231955]. Снова — направление антагонизма (сторона SR8278), а не агонизма, является терапевтическим ходом в этом пластичном контексте.

REV-ERBα как супрессор опухоли: агонист помогает через иммунитет

В раке молочной железы NR1D1/REV-ERBα может вести себя как опухолевый супрессор, и здесь агонист SR9009 действует через иммунитет, а не прямую цитотоксичность: NR1D1 способствует накоплению цитозольной ДНК при повреждении ДНК и активирует cGAS-STING, повышая интерферон I типа и хемокины CCL5/CXCL10, усиливая инфильтрацию CD8+ T-клеток и NK; делеция Nr1d1 у мышей MMTV-PyMT увеличивает рост опухоли и метастазы в лёгкие, а SR9009 усиливает противоопухолевый иммунитет типа I IFN и подавляет прогрессию/метастазирование [37395684]. Это направление эффекта отличается от клеточно-автономной летальности Sulli и подчёркивает опухоль-типовую зависимость роли REV-ERBα.

Дополнительные оговорки к антагонисту SR8278

• REV-ERB-независимость антипролиферации SR8278: в человеческих кератиноцитах SR8278 замедляет рост и нарушает переход G1/S (подтверждено RNA-seq) без генотоксического стресса и апоптоза, и CRISPR/Cas9-нокаут плюс siRNA-нокдаун REV-ERB НЕ отменяют эти эффекты — авторы предостерегают не приписывать фенотипы SR8278 к REV-ERB без комплементарных генетических контролей, особенно в исследованиях пролиферации [41897352].
• Цитопротекция антагонистом при химиотерапии: SR8278 (как и ингибитор криптохрома KS15) защищал культивируемые человеческие клетки от антипролиферативного действия цисплатина, повышая фактор эксцизионной репарации нуклеотидов XPA и регуляторы цикла Wee1 и p21, снижая число неотрепарированных цисплатин-ДНК-аддуктов и обогащая G1-арест [34504274]. Это противоположно прямому цитотоксическому/химиосенсибилизирующему действию и предупреждает, что REV-ERB-антагонизм плюс ДНК-повреждающие агенты могут притуплять, а не усиливать гибель.

Вспомогательные (не первичные) свидетельства

• In silico: молекулярный докинг/динамика указывают, что SR9009 связывает REV-ERBα (NR1D1) с высокой аффинностью (энергия связывания ~ −220 кДж/моль против ~ −155 кДж/моль у доксорубицина) среди панели мишеней рака молочной железы, номинируя SR9009 как REV-ERBα-направленный кандидат; это только вычислительное, гипотез-генерирующее свидетельство без клеточного анализа [40230904].
• Обзорный контекст: обзор роли REV-ERB в онкогенезе отмечает, что экспрессия REV-ERB в большинстве исследованных опухолей снижена, что вовлечено в кахексию, и что фармакологическое восстановление их эффекта возможно синтетическими агонистами (доклинические данные скудны, нужны механистические исследования) — полезно как вторичная ссылка/обрамление, но не как первичное доказательство летальности в названных линиях [37240325].

Пробелы/неопределённости

• MDA-MB-231: ни одно из подтверждённых исследований не сообщает о цитотоксичности SR9009/SR9011 или SR8278 конкретно в MDA-MB-231 с on-target (shRNA/нокаут) подтверждением; данные Nature 2018 по РМЖ — это MCF-7 и T47D (детали полного текста), а панель SR9011 2015 г. [26074263] не выделяет MDA-MB-231 в абстракте. Трижды-негативная MDA-MB-231-специфичная REV-ERB-агонист-летальность — реальный пробел.
• Липогенез в HCT116: считывание de novo липогенеза (FASN/SCD1, обеднение свободных жирных кислот, спасение олеиновой кислотой) в опубликованном тексте количественно показано в глиобластоме (A172) и миеломе, но не измерено напрямую в HCT116; в HCT116 первичное свидетельство — апоптоз/жизнеспособность и REV-ERB-shRNA-зависимость (полный текст), так что липогенная ветвь в колоректальной линии выведена, а не прямо продемонстрирована [29320480][38022411].
• HEK293: ни одна из подтверждённых работ не тестирует SR9009/SR9011 или SR8278 как цитотоксик в HEK293; в этой литературе HEK293 фигурирует только как контроль/нормально-клеточный компаратор, что согласуется с утверждением Nature 2018 о щажении незлокачественных клеток [29320480].
• SR8278 в названных линиях: нет прямого доказательства, что антагонист SR8278 цитотоксичен именно в HCT116 или в линиях РМЖ; его противоопухолевые данные лежат в контекстах «функциональной инверсии REV-ERBα» (простата/NEPC — [39383000], [41231955]), его антипролиферация в кератиноцитах REV-ERB-независима/off-target [41897352], а при цисплатине SR8278 был цитопротективным [34504274]. Направленность «агонист vs антагонист» в названных колоректальной/молочной линиях не разрешена.
• On-target vs off-target: off-target-активность SR9009 (LXRα/FOXM1 в простате — [36357378]) и REV-ERB-независимые эффекты SR8278 [41897352] означают, что любое утверждение о REV-ERB-как-мишени в HCT116/MCF-7 требует генетического (shRNA/CRISPR) подтверждения для on-target-атрибуции; для агонистов в HCT116/MCF-7 такое подтверждение обеспечивает полный текст Nature 2018 (shRNA-спасение), но сопоставимого генетического контроля для SR8278 в этих линиях нет.
• Ограничение верификации: линие-специфичные факты по Nature 2018 (HCT116, MCF-7/T47D, A172; TUNEL/caspase-3; ULK1/ULK3/BECN1/ATG7; FASN/SCD1) НЕ содержатся в абстракте PMID 29320480 и приняты как детали полного текста той же статьи; абстракт независимо подтверждает лишь обобщённую селективную летальность, p53/гипоксия-независимость и двойной механизм аутофагия+липогенез [29320480].

TIMELESS (TIMELESS–TIPIN): репликационно-репаративная ось clock-ассоциированного гена, выпавшая из PER/CRY/BMAL1-центрированного разбора

В отличие от канонических компонентов часов (PER1/2, CRY1/2, BMAL1), которые в этом обзоре разбирались как транскрипционно-трансляционная петля, TIMELESS (TIM) участвует в цикле клетки и стабильности генома напрямую — как структурный компонент комплекса защиты вилки (fork protection complex, FPC) вместе с TIPIN. Ниже верифицированная сводка по механизму, с явным разделением того, что показано прямо в названных линиях (HCT116, MDA-MB-231, MCF7), и того, что установлено лишь на общих/иных моделях.

1. Базовый механизм: TIMELESS–TIPIN и активация ATR–CHK1 / защита вилок (общемеханистические данные)

Основополагающее звено, связывающее TIMELESS–TIPIN с сигналингом ATR/CHK1, — взаимодействие TIPIN с 34-кДа субъединицей RPA: оно стабилизирует комплексы TIMELESS–TIPIN и TIPIN–Claspin на покрытой RPA одноцепочечной ДНК и тем самым способствует Claspin-опосредованному фосфорилированию CHK1 киназой ATR в ответ на генотоксический/репликационный стресс [20233725]. Микроскопические данные показывают, что комплекс TIMELESS–TIPIN действует как «универсальный страж» реплисомы: в невозмущённой S-фазе и при индукции репликационного стресса (гидроксимочевина, афидиколин) он остаётся связанным с хроматином и продвигается вместе с репликативной геликазой, пространственно диссоциируя от заблокированной полимеразы, а взаимодействие TIMELESS с RPA на ssDNA при стрессе усиливается [38487270]. Стабильность самого TIMELESS в FPC поддерживается PCNA-ассоциированным белком SDE2: как и дефицит TIM, нокдаун SDE2 нарушает продвижение и восстановление остановленных вилок, не активирует фосфорилирование CHK1 и ведёт к избыточной MRE11-зависимой деградации реверсированных вилок — то есть TIM защищает остановленные вилки в кооперации с BRCA-зависимой стабилизацией [33127907]. Обзорный синтез подтверждает эту рамку: TIM — ключевой каркас FPC; его потеря вызывает выраженный репликационный стресс и дефекты чекпойнта, тогда как гиперэкспрессия часта в опухолях и обеспечивает защиту от повреждений ДНК и химиорезистентность [37481157].

2. Ось TIMELESS–PARP1: DDR и оборот TIMELESS (общемеханистические данные)

TIMELESS образует физический комплекс с PARP1, отличный от комплекса TIMELESS–TIPIN: рекрутирование TIMELESS в лазер-индуцированные очаги повреждения зависит от связывания с PARP1 (но не от его каталитической активности), TIMELESS помогает привлекать субстраты PARP1 к повреждениям, а сайленсинг TIMELESS значимо ухудшает репарацию двухцепочечных разрывов [26456830]. Обратная регуляция: PARP1 поли(ADP-рибозил)ирует TIMELESS через два PAR-связывающих мотива, помечая его к протеасомной деградации; PARylation-рефрактерный мутант TIM (или ингибирование PARP) вызывает накопление TIM на вилках, репликационный стресс и гиперрезекцию остановленных вилок, нарушая загрузку RAD51 и защиту реверсированных вилок, а дефектный оборот TIM гиперсенсибилизирует BRCA2-дефицитные клетки — предложенный механизм действия PARP-ингибиторов через оборот TIMELESS [38393943].

3. HCT116 — наиболее сильная прямая клеточная модель для репликации/DDR (колоректальный рак)

Именно на HCT116 сосредоточена прямая механистическая работа по репликации и DDR. В HCT116 медиаторы чекпойнта Claspin и TIMELESS скоординированно гиперэкспрессированы в опухоли; их снижение до предопухолевого уровня замедляет продвижение вилок, не затрагивая сигналинг чекпойнта — то есть высокий TIMELESS обеспечивает толерантность к онкоген-индуцированному репликационному стрессу через защиту вилок независимо от чекпойнта [30796221]. С помощью auxin-индуцируемого дегрона в HCT116 показано, что острая деградация TIMELESS активирует чекпойнт ATR–CHK1, а совмещение потери TIM с ингибированием ATR приводит к репликационной катастрофе (накопление ssDNA, истощение RPA, DNA-PK-зависимая активация CHK1, MRE11-опосредованный разрыв вилок, гибель клеток), что определяет TIMELESS как репликационную уязвимость, эксплуатируемую ATR-ингибиторами [37144518]. В той же дегрон-модели HCT116 острая деградация TIM вызывает накопление ssDNA-пробелов из-за дефектного процессинга фрагментов Оказаки; взаимодействие TIM–PARP1 необходимо для PARylation-зависимого резервного пути (LIG1/FEN1) и рекрутирования XRCC1, а совместная утрата FEN1 и взаимодействия TIM–PARP1 синергически летальна — TIMELESS выступает синтетически-летальной мишенью ферментов процессинга Оказаки [38801073]. Партнёр TIMELESS по FPC — TIPIN — в HCT116 усиливает ATM-сигналинг, стимулируя резекцию концов и гомология-направленную репарацию после повреждений от ингибиторов топоизомераз; ATM фосфорилирует TIPIN, что необходимо для рекрутирования MDC1 к остановленным вилкам и ATM-зависимой активации NF-κB с индукцией c-FLIP, поэтому воздействие на ось ATM–TIPIN–MDC1 химиосенсибилизирует и подавляет терапия-индуцированное старение [41291151]. Наконец, в панели линий рака толстой кишки, включающей HCT116, активация ERK повышает экспрессию TIMELESS; депления TIMELESS увеличивает γH2AX и запускает G2/M-арест через рост фосфорилирования CHK1 и CDK1, причём комбинация деплеции TIMELESS с ингибированием Wee1 или CHK1 аддитивно снижает жизнеспособность опухолевых клеток, щадя нетрансформированный эпителий толстой кишки [30629587].

4. Прогноз при колоректальном раке — неразрешённое противоречие направления (обе стороны на HCT116)

Прогностическая направленность TIMELESS в CRC противоречива, и обе стороны используют HCT116. С одной стороны, TIMELESS гиперэкспрессирован относительно нормальной ткани за счёт CBP/p300-опосредованного H3K27-ацетилирования его промотора; TIM связывает Myosin-9, способствуя ядерной транслокации β-catenin и стимулируя пролиферацию, инвазию и EMT, а высокий TIM ассоциирован с продвинутой стадией TNM и худшей общей выживаемостью — то есть онкогенная, неблагоприятная-при-высоком-TIM роль [33971927]. С другой стороны, независимое исследование (HCT116 плюс две когорты пациентов, суммарно ~1159 образцов) сообщает противоположное: потеря TIMELESS — неблагоприятный прогностический фактор; нокдаун TIM снимает репрессию ZEB1, активируя EMT, миграцию, инвазию и стволовость и вызывая накопление повреждений ДНК с замедленным восстановлением, а опухоли low-TIM/high-ZEB1 (агрессивный подтип CMS4) имеют худший исход — то есть опухоль-супрессорная, неблагоприятная-при-низком-TIM роль [35034102]. Это подлинное, неразрешённое расхождение направления в CRC.

5. Рак молочной железы (MDA-MB-231 / MCF7): онкогенные транскрипционные/метаболические/иммунные роли — но НЕ репликация/DDR

Для названных молочных линий прямые данные концентрируются на сигналинге, а не на механике реплисомы. В MDA-MB-231 (и дополнительных молочных линиях) TIMELESS взаимодействует с c-Myc, усиливая транскрипцию PD-L1 (CD274); экспрессия TIM обратно коррелирует с инфильтрацией CD8+ T-лимфоцитов, а нокдаун TIM усиливает противоопухолевую активность CD8+ T-клеток — иммуносупрессивная, проагрессивная роль, причём высокий TIM ассоциирован с ответом на анти-PD-L1 [37340461]. В MDA-MB-231 TIM также взаимодействует с Sp1/c-Jun, индуцируя транскрипцию miR-5188 и запуская положительную петлю miR-5188–FOXO1/β-catenin/c-Jun, которая стимулирует стволовость, пролиферацию, метастазирование и химиорезистентность; miR-5188 повышен при раке молочной железы и коррелирует с плохим прогнозом [31604679]. В ER-положительной линии MCF7 TIMELESS повышен и связан с плохим прогнозом; он взаимодействует с Sp1, повышая alkaline ceramidase 2 (ACER2) и перестраивая метаболизм сфинголипидов/S1P для усиления пролиферации и митохондриального дыхания [33093451]. Отдельная работа на MCF7 определяет TIMELESS как коактиватор ERα: он связывает ERα и усиливает его транскрипционную активность (рекрутируется с ERα на промоторы GREB1 и cMYC), повышает экспрессию PARP1 и PARylation ERα через проксимальный LXXLL-мотив, что даёт механистическую основу для ассоциации TIMELESS с рецидивом/резистентностью к тамоксифену [29555554]. Ранняя экспрессионно-профилирующая работа на молочной (MCF7) и цервикальной линиях впервые оформила TIMELESS как биомаркер: он часто гиперэкспрессирован, повышенный уровень значимо связан с более продвинутой стадией и худшим прогнозом рака молочной железы, а siRNA-нокдаун снижает пролиферацию [24161199]. Важно: ни одна из этих прямых MDA-MB-231/MCF7-работ не тестирует защиту репликативных вилок или активацию ATR/CHK1 в этих линиях — репликационно-репаративный механизм для молочной железы остаётся экстраполяцией с HCT116 и общемеханистических данных.

6. Прогностический/пан-раковый и терапевтический контекст

Пан-раковый биоинформатический + IHC-анализ показывает, что TIMELESS гиперэкспрессирован в большинстве типов опухолей; аномальная экспрессия значимо связана с продвинутой стадией и худшим прогнозом рака молочной железы, коррелирует с MSI, мутационной нагрузкой (TMB) и иммунной инфильтрацией, а функциональные механизмы обогащены по клеточному циклу, репликации ДНК, циркадному ритму и mismatch-репарации [38053143]. Терапевтическая эксплуатация FPC подтверждается на иных моделях: в линиях мелкоклеточного рака лёгкого (H146, H82, DMS114) пероральный ATR-ингибитор M1774 (тувусертиб) блокирует ответ ATR–CHK1 на репликационный стресс от ингибиторов TOP1, количественная протеомика при действии ДНК-повреждающих агентов выявляет обогащение белков FPC — TIMELESS и TIPIN, — и M1774 широко синергичен с ингибиторами TOP1/TOP2, цисплатином и PARP-ингибиторами [38466804]. В клетках рака яичника внутренняя чувствительность к ингибиторам PARG воспроизводится гаплонедостаточностью TIMELESS («ускорителя реплисомы»), а добавление нуклеозидов спасает все фенотипы чувствительности (скорость реплисомы, остановку вилок, завершение S-фазы, клоногенность), указывая, что связанная с TIMELESS чувствительность к PARG-ингибиторам отражает неспособность контролировать скорость реплисомы / поддерживать сопряжение геликазы и полимеразы при нуклеотидном дисбалансе [39015544].

Пробелы/неопределённости

• HEK293: ни одно из найденных исследований не подтверждает репликационную/ATR-CHK1 роль TIMELESS/TIPIN именно в HEK293; механистическая дегрон/FPC-работа опирается на HCT116 и общие U2OS/HeLa/RPE-подобные модели.
• Прямой пробел по MDA-MB-231 и MCF7: ни одна прямая работа в этих линиях не тестирует защиту вилок или активацию ATR/CHK1 — эта DDR-механика для рака молочной железы выведена из HCT116 и общемеханистических данных, а прямые молочные данные касаются транскрипционных/метаболических/иммунных онкогенных ролей.
• Асимметрия силы доказательств: колоректальный рак (HCT116) имеет самую сильную прямую клеточную доказательную базу по репликации/DDR (защита вилок, ATR-CHK1, ssDNA-пробелы); молочные данные — преимущественно о ERα/метаболизме/иммунитете.
• Противоречие в прогнозе при CRC не разрешено: [33971927] и [30629587] трактуют TIMELESS как гиперэкспрессированный онкоген (плохой прогноз при высоком уровне), тогда как [35034102] — как опухолевый супрессор (плохой прогноз при низком уровне, через ZEB1/EMT). Обе стороны используют HCT116. Прогноз при раке молочной железы, напротив, консистентен: высокий TIMELESS = хуже.
• Прогноз ≠ измеренный механизм: ни одна работа не измеряет TIMELESS-зависимую скорость/защиту вилок или активацию ATR-CHK1 как прогностический драйвер в когорте пациентов рака молочной железы или CRC — прогностические ассоциации основаны на экспрессии (IHC/TCGA), а механизм защиты вилок установлен только на клеточных линиях.
• Уточнение к [35034102]: две когорты суммарно ~1159 образцов (не «две по 1000+»).

Циркадное «гейтирование» NER (XPA) и платино-/оксалиплатин-чувствительность: ось Sancar и её приложимость к HCT116

1. Каноническая ось clock → XPA → NER → платина (установлена в тканях мыши и в неколоректальных клетках человека)

Фундамент оси Sancar составляет наблюдение, что XPA — фактор распознавания повреждения и лимитирующее звено nucleotide-excision repair (NER) — циркадно осциллирует в печени мыши, но не в семеннике; как следствие, удаление cisplatin-DNA-аддуктов в экстрактах печени идёт с зенитом около 17:00 и надиром около 05:00, тогда как в семеннике ритма нет. Осцилляция XPA задаётся одновременно транскрипционно (кор-белками часов, включая cryptochrome) и посттрансляционно — убиквитинлигазой HERC2 [20304803]. Тот же ритм NER воспроизводится in vivo в мозге: в коре больших полушарий мыши активность NER максимальна во второй половине дня/вечером и минимальна ночью/ранним утром, и этот ритм по меньшей мере отчасти обусловлен циркадной осцилляцией именно белка XPA [19164551]. Аналогичная картина показана в коже мыши, где ритмичны и XPA, и скорость эксцизии (минимум утром, максимум днём/вечером), причём облучение UV в фазе низкого XPA (04:00) давало примерно пятикратно больше инвазивных плоскоклеточных карцином, чем облучение в 16:00 — прямое сцепление фазы «низкий XPA / низкий NER» с канцерогенным исходом для bulky-аддуктов [22025708].

Механизм лимитирующей роли XPA и его двойной регуляции воспроизведён в человеческих клетках, но не в колоректальной линии: во всех протестированных человеческих линиях (включая нормальные фибробласты) XPA является rate-limiting фактором эксцизионной репарации, его уровень контролируется транскрипционно молекулярными часами и посттрансляционно E3-лигазой HERC2; нокдаун HERC2 стабилизирует XPA и умеренно повышает репарацию, а siRNA против XPA снижает репарацию пропорционально уровню белка [21193487]. Обзорно XPA закреплён как фактор, необходимый для репарации именно платиновых bulky-повреждений, и как потенциальный прогностический/предиктивный биомаркёр платинового ответа — с оговоркой о значительной межисследовательской вариабельности (высокий XPA/NER → лучшая репарация аддуктов → платино-резистентность; низкий XPA → чувствительность) [32235701]. Направленность оси суммирована в обзорах Sancar-школы: NER (через ритмичный XPA) и ATR-контрольная точка демонстрируют суточную осцилляцию каталитической активности под контролем часов [34064641]; в интегративном синтезе подчёркнуто, что часы контролируют ~50% кодирующих генов, а сам автор осторожен — эмпирические попытки хронохимиотерапии пока не дали однозначного клинического выигрыша, и именно mechanism-based картирование cisplatin-повреждений/репарации по циркадному времени должно дать рациональную схему [34375638].

Ключевой момент для целевого обзора: вся эта каноническая ось установлена в тканях мыши (печень, семенник, мозг, кожа) и в неколоректальных человеческих клетках (фибробласты/«human cells»), но ни в HCT116, ни в какой-либо другой named колоректальной линии циркадная осцилляция XPA/NER-опосредованной репарации платиновых аддуктов напрямую не измерена.

2. Геном-широкая кинетика репарации платиновых аддуктов и роль генов часов

XR-seq-картирование репарации cisplatin-аддуктов в печени мыши разделило два циркадных «режима»: (1) транскрипционно-направленную репарацию транскрибируемой цепи ~2000 clock-controlled генов, ритмичную в фазе транскрипции каждого гена и практически завершающуюся за ~2 суток, и (2) собственно эксцизионную активность с единой фазой под контролем часов, обрабатывающую нетранскрибируемую цепь и остальной геном в течение недель [31217280]. При нокауте генов часов картина меняется по-разному: в печени и почке мыши ритмичная репарация нетранскрибируемой цепи утрачивается во всех трёх генотипах (Cry1/2−/−, Per1/2−/−, Bmal1−/−), тогда как ритмичная репарация транскрибируемой цепи сотен генов сохраняется у двойных мутантов Cry и Per — то есть часть транскрипционно-сопряжённой репарации частично clock-независима; авторы прямо позиционируют это как основу для «time-aware» платиновых вмешательств [38359290]. Интеграция Damage-seq/XR-seq/RNA-seq показала, что спектры образования Pt-d(GpG)-аддуктов и их эксцизии заметно различаются между органами мыши (почка, печень, лёгкое, селезёнка) в зависимости от тканевого транскриптома и эпигенома — механистическое объяснение тканеспецифичной платиновой токсичности/резистентности [30659176]. Всё это — модели тканей мыши, не колоректальная линия.

3. Фармакологическая модуляция часов меняет платино-чувствительность (человеческие клетки, но не HCT116)

Прямое подтверждение того, что модуляция часов сдвигает NER-опосредованную платино-чувствительность, получено в культивируемых человеческих клетках: комбинация ингибитора cryptochrome (KS15) и ингибитора REV-ERB (SR8278), усиливающая транскрипционный выход часов, повышала XPA, а также регуляторы клеточного цикла Wee1 и p21, снижала число нерепарированных cisplatin-DNA-аддуктов, увеличивала долю клеток в G1 и защищала клетки от антипролиферативного действия cisplatin [34504274]. Важна направленность: усиление выхода часов → выше XPA + G1-арест → больше репарации аддуктов → платино-резистентность (протекция), а не сенситизация. Линия при этом — «human cell lines» общего назначения, не HCT116.

4. Что реально показано напрямую в HCT116 — это 5-FU, а не платина, и не через NER/XPA

Единственные прямые в HCT116 clock-механизмы хемочувствительности касаются пиримидинового метаболизма и ферроптоза, а не NER/платины. Геном-широкий CRISPR-скрин (проведён в SW480) с последующей валидацией установил, что кор-активатор часов BMAL1 связывает E-box в промоторе UMPS и других генов пиримидинового метаболизма, повышая их экспрессию и ферментативную активность и поддерживая суточную эффективность 5-fluorouracil; механизм подтверждён нокдауном/оверэкспрессией, проточной цитометрией и — по полному тексту — именно на ксенографтах HCT116 (in vitro/in vivo валидация BMAL1→UMPS→5-FU) [35903686]. Второй, не-NER путь: ген семейства часов ARNTL2 (BMAL2) усиливает резистентность клеток рака толстой кишки к 5-FU, напрямую связывая промотор цистинового транспортёра SLC7A11 и подавляя ферроптоз (ось ARNTL2–SLC7A11, деградируемая мелатонином через убиквитин-протеасому) [40753759]. Оба механизма показывают, что tumor-intrinsic часы действительно управляют хемочувствительностью в колоректальных клетках, но через drug-metabolism/ферроптоз, а не через XPA/NER, и применительно к 5-FU, а не к платине.

5. Оксалиплатин-специфичная связь «часы ↔ репарация аддуктов» — показана в других моделях, не в HCT116-контексте NER

Связь clock-репрессоров с оксалиплатином установлена в колоректальных линиях DLD-1/SW480 и в OSCC, но не как NER/XPA-механизм в HCT116. CRY2 гиперэкспрессирован в химиорезистентных колоректальных опухолях и коррелирует с плохой выживаемостью; нокдаун CRY2 повышал чувствительность к оксалиплатину (продемонстрировано в DLD-1 и SW480), а E3-лигаза FBXW7 убиквитинирует CRY2 по фосфо-Thr300 и ускоряет его деградацию — при этом эксперименты по turnover CRY2 выполнены в HCT116 и HCT116 FBXW7−/− (то есть HCT116 использована для механизма деградации, а оксалиплатиновый arm — в DLD-1/SW480) [25855785]. В плоскоклеточной карциноме полости рта (OSCC) репрессор PER2 потенцирует цитотоксичность и апоптоз от оксалиплатина, периодически подавляя транскрипцию PCNA: PER2 CRY1/2-зависимо снимает гетеродимер CLOCK–BMAL1 с промотора PCNA, что затрудняет репарацию оксалиплатиновых DNA-аддуктов; согласование дозирования с ритмом PER2 повышало эффективность у опухоленосных мышей, а PER2 предложен как биомаркёр тайминга оксалиплатина [31728273]. Направленность здесь противоположна платино-протекции из раздела 3: высокий PER2 → меньше репарации аддуктов → больше оксалиплатин-индуцированного апоптоза. Ни в одной колоректальной линии фаза, максимизирующая гибель от оксалиплатина именно через NER, не картирована.

6. Исследование FEN1 в HEK293T, которое сейчас цитирует DDR-раздел обзора

Работа, на которую опирается текущий DDR-раздел: time-series RNA-seq по шести циркадным точкам в синхронизированных HEK293T показал, что нокдаун FEN1 (flap-эндонуклеаза репликации/репарации) изменяет ~30% осциллирующих транскриптов (потеря/появление ритма, сдвиги фазы, изменения амплитуды) с обогащением по путям DNA-damage-response, клеточного цикла и сенесценции, и сопровождается снижением входа в S-фазу и накоплением в G1 [41980678]. Это HEK293 (эмбриональная почка) и transcriptomic/репликационная направленность — работа не затрагивает clock-гейтированный NER/XPA или платиновую токсичность, то есть именно тот пробел, что критичен для HCT116-хемочувствительности.

7. Критическое предупреждение для будущих клеточных экспериментов

Есть прямое контр-свидетельство из той же школы: клеточные линии мыши с мутациями часов (Bmal1, CLOCK, Cry1/2, Per1/2) оказались неотличимы от дикого типа по ответу на UV, ионизирующее излучение и mitomycin C; вывод — либо большинство реакций DDR не контролируется часами, либо организменный контроль в культуре вытесняется гомеостатическими механизмами [22918252]. Практически это означает, что монослойный эксперимент на HCT116 может не воспроизвести in vivo-ритм clock→NER→платина, если часы не синхронизировать активно (например, dexamethasone/serum shock); иначе возможен ложно-нулевой результат.

8. Клинический контур: хрономодулированный оксалиплатин при колоректальном раке

Хрономодуляция оксалиплатина при CRC технически осуществима и активна: международное исследование EORTC 05011 (chronoIFLO5 — циркадно-таймированные irinotecan + oxaliplatin + 5-FU/leucovorin) при метастатическом CRC дало в первой линии ORR 62,3%, медиану PFS 8,7 мес и OS 19,9 мес при доле тяжёлой токсичности ~25% и обнадёживающей активности во второй линии с ограниченной гематологической токсичностью [33270911]. Однако агрегированные данные умеряют «эффективностный» тезис: метаанализ 7 РКИ (1137 пациентов с распространённым CRC) не выявил значимой разницы в ORR (RR 1,15; 95% CI 0,87–1,53), но показал крупное значимое снижение гематологической токсичности (RR 0,36; 95% CI 0,27–0,48) — то есть текущая клиническая польза хронотайминга при CRC — прежде всего снижение токсичности, а не рост ответа [37090313]. Кроме того, оптимальный тайминг сильно зависит от пола: пул-метаанализ рандомизированных хронотерапевтических исследований при метастатическом CRC (chronoFLO vs конвенциональная инфузия) показал, что мужчины жили дольше на chronoFLO (медиана OS 20,8 vs 17,5 мес; P=0,009), тогда как у женщин наблюдалась обратная картина (16,6 vs 18,4 мес; P=0,012), с сильным взаимодействием «пол × схема» [22745214]. Механистическую основу этого даёт доклиника: у мышей гематологическая и гематопоэтическая токсичность оксалиплатина зависит и от времени введения, и от пола — выраженные ритмы хронотоксичности с определённым оптимумом (около ZT15) у самок и почти отсутствие ритма при стандартной дозе у самцов [36432655]. Вывод для трансляции любой HCT116-производной гипотезы тайминга: «однократно зафиксированная» циркадная схема не универсально полезна.

Пробелы/неопределённости

• Нет прямого измерения циркадной осцилляции XPA или NER-опосредованной репарации платиновых аддуктов в HCT116 (или любой named колоректальной линии). Каноническая ось Sancar/Kang clock→XPA→cisplatin установлена только в тканях мыши [20304803; 19164551; 22025708; 31217280; 38359290; 30659176] и в неколоректальных человеческих клетках [21193487; 34504274]. Это и есть тот самый недостающий узел.
• ERCC1 как clock-controlled ген фактически отсутствует в верифицированной литературе: среди подтверждённых источников ни один не демонстрирует циркадную осцилляцию ERCC1 или ERCC1–XPF-инцизионной активности; ERCC1 фигурирует лишь как платино-резистентность/NER-биомаркёр (в обзоре XPA [32235701]). Является ли ERCC1 clock-гейтированным — по-видимому, не проверено, а не просто «не найдено».
• Прямые в HCT116 clock-данные касаются 5-FU и пиримидинового метаболизма (BMAL1→UMPS [35903686]) и ферроптоза (ARNTL2→SLC7A11 [40753759]), а не платины/оксалиплатина и не NER/XPA.
• Оксалиплатин-специфичный clock↔репарация-механизм показан в OSCC (PER2→PCNA [31728273]) и в DLD-1/SW480 (CRY2, с HCT116 лишь для деградации CRY2 [25855785]) — фаза, максимизирующая гибель от оксалиплатина, в колоректальной линии через NER не картирована. Обратите внимание на разнонаправленность верифицированных эффектов: усиление выхода часов даёт cisplatin-протекцию [34504274], тогда как высокий PER2 усиливает оксалиплатиновый апоптоз [31728273] — «единого знака» clock-эффекта нет.
• Клинически выигрыш хрономодулированного оксалиплатина при CRC на метаанализе сведён к снижению гематологической токсичности без значимого прироста ORR/выживаемости и с сильной половой зависимостью [37090313; 22745214; 36432655] — чистый тезис «таймировать оксалиплатин в надир NER ради лучшего убийства опухоли» пока клинически не обоснован.
• Методологическая оговорка сама подтверждена источником [22918252]: clock-мутантные клетки в монослое не воспроизвели in vivo-различия DDR, поэтому любой будущий HCT116-эксперимент по таймингу NER обязан активно синхронизировать часы, иначе нулевой результат не будет отражать биологию опухоли.

Циркадный контроль ферроптоза: ось часовых генов и GPX4/ACSL4/SLC7A11

Регуляция ферроптоза компонентами молекулярных часов оформилась как самостоятельная, быстро растущая ветвь литературы о регулируемой клеточной гибели. Однако применительно к трём заявленным клеточным моделям (HCT116, MDA-MB-231, MCF7) прямые функциональные доказательства крайне асимметричны: они практически исчерпываются толстокишечным контекстом (HCT116), тогда как для линий рака молочной железы прямых первичных работ по оси «часы → ферроптоз» на момент обзора нет (см. раздел «Пробелы/неопределённости»).

1. Прямая ось в толстокишечном контексте (единственное покрытие для HCT116)

Наиболее релевантный целевой результат — транскрипционный контроль системы xc- часовым геном ARNTL2 (BMAL2). В колоректальном раке ARNTL2 сверхэкспрессирован и связан с плохим прогнозом; он напрямую связывает промотор SLC7A11 и усиливает его транскрипцию, а дополнительно стабилизирует мРНК SLC7A11 через PHGDH, тем самым подавляя ферроптоз и обеспечивая резистентность к 5-фторурацилу; мелатонин деградирует ARNTL2 по убиквитин-протеасомному пути, обрушивая ось ARNTL2–SLC7A11 и ресенсибилизируя клетки к ферроптозу [40753759]. Ядро механизма (ARNTL2 → SLC7A11 → подавление ферроптоза / 5-FU-резистентность; мелатонин → деградация ARNTL2) полностью подтверждается рефератом; конкретизация функциональных линий как HCT116 и SW620 — деталь из полного текста методов (в реферате линии не названы), поэтому «HCT116-специфичность» здесь опирается на полнотекстовую верификацию, а не на реферат.

Ту же ось поддерживает эпигенетическая работа на клетках CRC: нокдаун LINC01232 или ARNTL2 усиливает эрастин-индуцированный ферроптоз; взаимодействие LINC01232 с p300 повышает H3K27ac на промоторе ARNTL2, активируя его транскрипцию, а сверхэкспрессия ARNTL2 реверсирует про-ферроптотический эффект нокдауна LINC01232 (с изменением MDA, Fe²⁺, железа, GSH, ROS) [39268727]. Реферат не уточняет, какая именно линия CRC несла ферроптозные тесты; HCT116 фигурирует лишь в полнотекстовом индексе, поэтому эту работу корректнее трактовать как «CRC-модель», косвенно укрепляющую ARNTL2-ось, а не как строгое HCT116-доказательство.

Третья работа этого блока — механизм клокофагии — формально включает HEK293T, но лишь как трансфекционный хозяин, а не как модель с эндогенным ферроптозным фенотипом. DCAF7 рекрутирует деубиквитиназу USP2, снижая K63-полиубиквитинирование BMAL1 и блокируя p62/SQSTM1-опосредованную селективную аутофагическую деградацию BMAL1 (клокофагию); стабилизированный BMAL1 через ось HIF1α–SLC7A11 подавляет ферроптоз, а нокаут DCAF7 или ингибирование USP2 запускают клокофагию-индуцированный ферроптоз. Фенотип функционально валидирован в линиях гепатоцеллюлярной карциномы (HCC), тогда как в HEK293 ферроптозный фенотип (липид-ROS, гибель по GPX4/SLC7A11) не показан [40877242].

2. BMAL1/BMAL2 и другие часовые факторы как супрессоры ферроптоза в прочих онкомоделях

За пределами толстой кишки консистентно воспроизводится мотив «часовой ген = супрессор ферроптоза», но каждый раз через собственный медиатор:

• AML (BMAL1 → церамид → GPX4): BMAL1 сверхэкспрессирован в AML и действует как супрессор ферроптоза; его деплеция ремоделирует метаболизм церамидов (BMAL1 → IKZF2 → ASAH2), накопление церамида стимулирует деградацию GPX4 и ферроптоз, сенсибилизируя клетки к сорафенибу [40241743].
• NSCLC (BMAL2 → MRPL15): BMAL2 связывает промотор MRPL15 (ChIP-qPCR, люцифераза) и трансактивирует его; MRPL15 подавляет и ферроптоз, и апоптоз, так что ось BMAL2–MRPL15 драйвит рост NSCLC, а индукция ферроптоза/апоптоза реверсирует онкогенный эффект BMAL2 [41075325].
• LUAD (TIMELESS → трансферрин): часо-ассоциированный РНК-связывающий белок TIMELESS связывает CNOT3, ускоряя деградацию мРНК трансферрина (TF), чем подавляет трансферрин-опосредованный ферроптоз и стимулирует рост LUAD; деплеция TIMELESS в комбинации с эрастином и анти-PD-1 усиливает ферроптоз и эффективность иммунотерапии [41641368].
• Рак яичника (NR1D2 → FSP1): циркадный ядерный рецептор NR1D2 (REV-ERBβ) повышен в цисплатин-резистентных клетках; его сайленсинг увеличивает MDA и ион двухвалентного железа, снижает FSP1 и восстанавливает чувствительность к цисплатину — то есть NR1D2 подавляет ферроптоз и поддерживает химиорезистентность [40591055].
• Иммунное уклонение (FABP7 → Bmal1/Lpcat3): белок, связывающий жирные кислоты, FABP7 в PD1-резистентных опухолях эпигенетически повышает транскрипцию про-протективного часового гена Bmal1 и снижает Lpcat3, наращивает триглицериды и MUFA, что тормозит перекисное окисление липидов и ROS, укрывая клетки от CD8⁺-T-клеточного/иммунного ферроптоза; FABP7 также нарушает экспрессию часовых генов в самих CD8⁺-T-клетках [39901247].

Общий вектор этих работ (BMAL1/BMAL2/TIMELESS/NR1D2 = супрессоры ферроптоза, их потеря/ингибирование = ферроптоз и химио-/иммуносенсибилизация) устойчив, но ни одна из моделей не является HCT116/MDA-MB-231/MCF7.

3. Клинические тканевые когорты: обратная связь «часы ↔ ферроптоз»

Две IHC-когорты задают клинический контекст обратной корреляции, релевантный в том числе для колоректального поля:

• CRC, 63 пациента: на продвинутой стадии (преимущественно T3) повышены маркёры ферроптоза TFRC, ALOX5, ACSL4, GPX4 и снижены циркадные регуляторы BMAL1, CLOCK, PER1, PER2; стадийно-зависимая динамика особенно выражена для BMAL1 в правосторонних опухолях [40959856]. (Строго говоря, реферат описывает стадийную дивергенцию — рост ферроптозных и падение часовых маркёров — то есть обратную связь на уровне стадий; формулировку о «прямой обратной корреляции по маркёрам» следует читать в этом стадийном смысле.)
• PDAC, 41 пациент: маркёры ферроптоза (TFRC, ALOX5, ACSL4, GPX4) прямо ассоциированы со смертностью, а циркадные регуляторы (CLOCK, BMAL1, PER1, PER2) — обратно; TFRC — сильнейший рисковый маркёр (HR≈35.9), CLOCK — сильнейший протективный (HR≈0.018), и циркадные регуляторы обратно коррелируют с ферроптозными [39199335].

Обе работы — ассоциативные (IHC-корреляции), а не механистические, но они единственные привязывают связку «ACSL4/GPX4/TFRC/ALOX5 vs BMAL1/CLOCK/PER» к человеческой опухолевой ткани.

4. Механистически-общие (не-онкологические) прямые оси «часы → GPX4/ACSL4/SLC7A11»

Наиболее чистые молекулярные доказательства прямого контроля ключевых ферроптозных узлов часовыми генами получены вне онкологических линий:

• BMAL1 → ритмический GPX4: в почечных NRK-52E BMAL1 управляет ритмической экспрессией GPX4; нарушение BMAL1 разрушает ритм GPX4 и снижает его уровень, вызывая перекисное окисление липидов и ферроптоз (ось BMAL1/GPX4) [39561408].
• Rbbp6/Bmal1/YAP1 → GPX4 и SLC7A11: Rbbp6 убиквитинирует и деградирует Bmal1; потеря Bmal1 снижает GPX4 и SLC7A11, повышает MDA/4-HNE/железо и запускает ферроптоз через супрессию YAP1, тогда как сверхэкспрессия Bmal1 восстанавливает GPX4/SLC7A11/GSH (клетки GC-1 spg / диабетическое яичко) [39501569].
• Per1/Per2 → баланс ACSL4/GPX4: двойной нокаут Per1/Per2 повышает про-ферроптозные Acsl4, Cd36, Atm и снижает антиферроптозный GPX4 в лимфоцитах селезёнки стареющих мышей, поднимая MDA, ROS и TFR1 — прямое генетическое свидетельство сдвига ACSL4/GPX4-баланса при потере PER [36361751].
• NFIL3 (E4BP4) → ACSL4: циркадный ген NFIL3 драйвит ферроптоз, повышая ACSL4 в почечном тубулярном эпителии при сепсис-ассоциированном ОПП; нокдаун NFIL3 снижает ACSL4 и ослабляет ферроптоз и воспаление [39097582].
• PER2 → кардиальный ферроптоз: 17β-эстрадиол повышает кардиальный Per2 и кардиопротективные miRNA, снижая маркёры ферроптоза; дефицит эстрогена снижает Per2 и усиливает ферроптоз и кардиодисфункцию у овариэктомированных крыс [40023607].
• BMAL1/NRF2 → суточная (ZT-зависимая) чувствительность: при почечной ишемии-реперфузии снижение BMAL1 подавляет NRF2 и усугубляет ферроптотическое повреждение, более выраженное в ZT12, чем в ZT0 — демонстрация часо-контролируемой временнóй восприимчивости к ферроптозу [40564094].
• BMAL1 → чувствительность к RSL3: снижение BMAL1 сенсибилизирует нейроны HT-22 к RSL3-индуцированному (ингибитор GPX4) ферроптозу через окислительный стресс и перегрузку железом; в мышиной модели ЧМТ нарушены BMAL1/CLOCK/PER2, а связь асимметрична (дисрегуляция часов → ферроптоз, но ингибирование ферроптоза лишь частично модулирует часы) [41320098].

Эти работы дают самое надёжное молекулярное основание для тезиса «BMAL1/PER непосредственно управляют GPX4, SLC7A11 и ACSL4», но получены на почечных, семенниковых, лимфоидных, кардиальных и нейрональных моделях, а не на HCT116/MDA-MB-231/MCF7.

5. Обзорный/контекстный слой (не тестирует ферроптоз напрямую)

Два обзора задают терапевтическую рамку, но сами по себе ферроптозных экспериментов не содержат и цитируются здесь как контекст, а не как доказательство. Первый систематизирует циркадные ядерные рецепторы REV-ERB и ROR как мишени малых молекул (агонисты/инверсные агонисты) для противоопухолевой терапии — рамка «часо-направленной» химиотерапии, внутри которой располагается и контроль регулируемой гибели [41465212]. Второй связывает часовые гены (BMAL1, REV-ERB, DEC) с ферментами синтеза жирных кислот (SREBP, ACLY, ACC, FASN, SCD) в раке и обосновывает хронотерапию [38189049]; поскольку уровень SCD/MUFA и ремоделирование липидов — прямые детерминанты восприимчивости к ферроптозу, этот обзор служит механистическим мостом «часы → липогенез → перекисное окисление», однако сам термин «ферроптоз» в его реферате не фигурирует, и связь остаётся выводной.

Пробелы/неопределённости

• MDA-MB-231 и MCF7: прямых первичных работ, функционально связывающих любой ядровой часовой ген (BMAL1/ARNTL, PER, CRY, ARNTL2, NR1D1/2) с ферроптозом, GPX4, ACSL4, SLC7A11 или перекисным окислением липидов в этих линиях РМЖ, среди верифицированных источников нет. Это подлинное «белое пятно».
• HCT116: единственная прямая ось «часы → ферроптоз» — это ARNTL2 → SLC7A11 [40753759] (плюс косвенно ARNTL2-эпигенетика в CRC [39268727]). Контроля GPX4 или ACSL4 через PER1/PER2 или CRY1/CRY2 в HCT116, равно как ритмической BMAL1-регуляции GPX4 в HCT116, нет; ось BMAL1/GPX4 показана лишь в почечных NRK-52E [39561408].
• HEK293: появляется исключительно как трансфекционный хозяин в разборе клокофагии/убиквитинирования BMAL1 (DCAF7/USP2/p62) [40877242]; эндогенного ферроптозного фенотипа в самой HEK293 не сообщается.
• Хронотерапия / ZT-зависимость: суточная (ZT-гейтированная) чувствительность к ферроптозу подтверждена только в почечной ишемии-реперфузии (ZT12 > ZT0) [40564094] и не тестировалась ни в одной из четырёх заявленных линий; дозирование индукторов ферроптоза по циркадной фазе в HCT116/MDA-MB-231/MCF7/HEK293 не исследовано.
• Прямое транскрипционное связывание ACSL4 часовым фактором: промоторных/ChIP-доказательств связывания ACSL4 (или GPX4) фактором BMAL1/PER в четырёх заявленных линиях нет; данные либо корреляционные (IHC-когорты CRC/PDAC [40959856; 39199335]), либо непрямые через NFIL3 в почке [39097582].
• Семейства PER и CRY в опухолевой линии человека: контроль ферроптоза со стороны PER1/PER2/PER3 или CRY1/CRY2 в человеческой раковой линии по существу не изучен; имеющиеся PER2→ферроптоз данные — кардиальные/крысиные [40023607] и селезёночно-лимфоцитарные/мышиные [36361751].
• Статус обзоров: [41465212] и [38189049] — обзоры без собственных ферроптозных экспериментов; они обеспечивают терапевтический и липидно-метаболический контекст, но не являются прямым доказательством оси «часы → ферроптоз».

Циркадный контроль экспрессии иммунных чекпоинтов и тайминга иммунотерапии при раке молочной железы и колоректальном раке

1. Единственный прямой механизм «clock-фактор → промотор CD274»

Наиболее прямая на сегодня молекулярная связь между компонентом часов и промотором CD274 показана не в молочной железе и не в толстой кишке, а в меланоме: nuclear receptor RORA связывается непосредственно с промотором CD274 и формирует репрессорный комплекс с HDAC3, подавляя экспрессию PD-L1; DEAD-box хеликаза DDX3X конкурирует с HDAC3 за связывание с RORA, высвобождает RORA из комплекса и тем самым повышает PD-L1 и формирует иммуносупрессивное окружение [38718296]. Оверэкспрессия/агонизм RORA усиливает цитотоксический Т-клеточный ответ, а комбинация агониста RORA с анти-CTLA4 синергично повышает противоопухолевый иммунитет in vivo [38718296]. Важно для целевой темы: это единственная продемонстрированная прямая оккупация clock-фактором промотора CD274, и она получена в меланоме — прямой оккупации CLOCK/BMAL1 на E-box промотора CD274 ни в одной линии молочной железы или колоректального рака в проверенной литературе не показано.

2. Молочная железа: ядро часов влияет на PD-L1 непрямыми путями (MCF7, MDA-MB-231)

В раке молочной железы прямая связь ядерного clock-гена с PD-L1 опосредованная, а не через E-box. Повышенная экспрессия CLOCK является независимым неблагоприятным прогностическим фактором и коррелирует со сниженной инфильтрацией CD8⁺ Т-клеток, повышенной поляризацией M2-макрофагов и повышенной экспрессией PD-L1 в датасете TCGA BC [41261416]. Механистически CLOCK опосредует ацетилирование NF-κB p65 по K56, потенцируя NF-κB-зависимую транскрипционную активацию PD-L1; нокдаун CLOCK (sh-CLOCK) в клетках MCF-7 по данным RNA-seq подавляет пути NF-κB/TNF/MAPK и снижает PD-L1 [41261416]. Это прямые данные на именованной линии (MCF7), но механизм — ось CLOCK → ацетилирование p65 → PD-L1, а не прямое связывание часов с промотором CD274.

Для MDA-MB-231 прямых данных о манипуляции ядром часов (BMAL1/CLOCK) с считыванием по PD-L1 нет. Единственная проверенная связь MDA-MB-231 с PD-L1 в циркадном контексте — непрямая, через циркадный выходной гормон мелатонин: мелатонин снижает сигналинг FAK и PD-L1 в TNBC-линиях, включая MDA-MB-231 (а также MDA-MB-468 и мышиную 4T1), усиливает химиочувствительность к цисплатину и оказывает иммуномодулирующий противоопухолевый эффект in vivo (рост CD8⁺-инфильтрации, снижение PD-L1 и FOXP3⁺ Treg), тогда как оверэкспрессия FAK восстанавливает PD-L1 и резистентность [41799764]. То есть MDA-MB-231-данные существуют, но через ось melatonin/FAK, а не через манипуляцию core-clock.

3. Колоректальный рак и кишечный эпителий: ритмичное чекпоинт-биологическое звено — только на мышиных моделях

Наиболее убедительные CRC-данные о том, что часы гейтируют чекпоинт-биологию и диктуют тайминг иммунотерапии, получены на генетической мышиной модели колоректального рака: нарушение часов эпителиальных клеток усиливает секрецию цитокинов, воспаление и рекрутинг нейтрофилов, что ведёт к развитию PD-L1-экспрессирующих MDSC, чья численность ритмично достигает пика и подавляет цитотоксические CD8⁺ Т-клетки; анти-PD-L1 наиболее эффективен, когда время его введения синхронизировано с пиком иммуносупрессивных MDSC [38806707]. Это прямое доказательство циркадного гейтинга чекпоинт-иммунитета в CRC — но на мышиной генетической модели, не в клеточных линиях человека.

Второе CRC-релевантное звено — на моделях колита и колит-ассоциированного рака: BMAL1 транскрипционно таргетирует IL-33, поддерживая PDL1⁺ регуляторные B-клетки (Breg) в интраэпителиальных лимфоцитах кишечника; у мышей Bmal1⁻/⁻ (и при социальном джетлаге, а также у Per1⁻/⁻Per2⁻/⁻) PDL1⁺ Breg дисрегулированы, что вызывает аберрантную гибель активированных CD4⁺ Т-клеток, более тяжёлый колит и усугубляет колит-ассоциированный CRC; низкая экспрессия Bmal1 в тканях пациентов с CRC ассоциирована с худшим прогнозом [33652118]. Это прямая связь BMAL1 → IL-33 → PDL1⁺ иммунная клетка в колоректальной модели заболевания, но опять же не в линии типа HCT116.

Прямой транскрипционный контроль clock-гена в толстой кишке продемонстрирован и вне чекпоинт-контекста: ARNTL2 (BMAL2) гиперэкспрессирован в раке толстой кишки, коррелирует с плохим прогнозом, напрямую связывается с промотором SLC7A11, усиливая его транскрипцию (и стабилизирует его мРНК через PHGDH), подавляя ферроптоз и обеспечивая резистентность к 5-FU [40753759]. Это доказывает способность clock-гена к прямому промоторному контролю в толстой кишке, но считывание здесь — ферроптоз/химиорезистентность, а не PD-L1/чекпоинт.

4. Дополнительные модели: ядро часов драйвит иммуносупрессию и определяет эффект чекпоинт-блокады

За пределами прямой темы, но механистически опорно, циркадный контроль чекпоинт-биологии подтверждён в нескольких других опухолях:

• Gastric (якорь PER2 → M-MDSC): нокдаун PER2 в раке желудка повышает PD-L1 и IL-10 при подавлении Т-клеточной активации, драйвит накопление моноцитарных MDSC (M-MDSC) и метаболическое перепрограммирование (гликолиз, метаболизм жирных кислот) через VEGF/IL-6 → STAT3 и лактат, и придаёт резистентность к анти-PD-1 с дисфункцией CD8⁺; нейтрализация VEGF/IL-6 или ингибирование лактата восстанавливает активность CD8 [41928364]. Это тот самый желудочный якорь PER2 → M-MDSC, за который обзор должен выходить.
• Melanoma (тайминг дозирования): репрессор часов DEC2 (BHLHE41) ритмично подавляет NF-κB-зависимую транскрипцию Pdcd1 (PD-1), формируя суточную экспрессию PD-1 на опухоль-ассоциированных макрофагах (TAM); малая молекула-ингибитор PD-1/PD-L1 BMS-1 значимо эффективнее при введении во время суточного пика PD-1 на TAM (B16/BL6) [35190830]. Это механистическая основа зависимости эффекта чекпоинт-ингибитора от времени суток.
• Glioblastoma (гетеродимер ядра часов): гетеродимер CLOCK-BMAL1 в глиомных стволовых клетках напрямую трансактивирует legumain (LGMN) (усиливается плечом CLOCK-OLFML3-HIF1α), поляризуя микроглию в иммуносупрессивный фенотип; блокада оси CLOCK-OLFML3-HIF1α-LGMN повышает инфильтрацию/цитотоксичность CD8⁺ и синергична с анти-PD-1 [35413115].

5. Циркадное позиционирование CD8⁺ Т-клеток в опухолевом микроокружении

Помимо экспрессии чекпоинтов, часы управляют пространственным позиционированием ICI-релевантных эффекторов: внутриопухолевое распределение CD8⁺ Т-клеток меняется в зависимости от времени суток через суточную экспрессию CXCR4, что определяет time-dependent миграцию к CXCL12-экспрессирующим опухоль-ассоциированным фибробластам (CAF); амплитуда ритма CXCR4 больше в опухоль-инфильтрирующих Т-клетках, чем в селезёночных, и воспроизводится в scRNA-seq человеческого рака лёгкого [41257391]. Это циркадный механизм, позиционирующий CD8⁺ Т-клетки внутри TME и потенциально модулирующий эффективность ICI.

6. Клиническая трансляция: тайминг иммунотерапии

Клиническое звено «утреннего» дозирования согласовано, но доминируют лёгочные/меланомные/смешанные когорты, без специфичных РМЖ- или CRC-исследований:

• Реальная когорта 969 пациентов, получавших анти-PD-1/PD-L1 при солидных опухолях (UCI Health): раннее (до полудня) введение ассоциировано со значимо более высоким disease control rate, чем позднее (49% против 40%; скорректированный OR 1.18, 95% CI 1.02–1.38), направленно согласованно по полу, возрасту, стадии и агенту ICI [42316066].
• Систематический обзор и мета-анализ 29 исследований (6129 пациентов с распространёнными солидными опухолями): более раннее время введения ICI ассоциировано с лучшей общей выживаемостью (HR 0.60, 95% CI 0.51–0.70) и выживаемостью без прогрессирования (HR 0.62, 95% CI 0.54–0.71) — высший уровень синтеза в пользу утреннего дозирования [42084869].
• Target-trial emulation при метастатическом NSCLC (Veterans Health Administration, проанализировано 1965 пациентов): дневные/вечерние (PM) инфузии ICI ассоциированы с худшей общей выживаемостью, чем утренние (HR 1.15, 95% CI 1.04–1.26; медиана OS 10.3 против 8.1 мес), тогда как исторический химиотерапевтический negative-control не показал эффекта времени суток — причинно-выводная поддержка специфичности эффекта именно для иммунотерапии [42134900].

7. Механистический субстрат и обзорный контекст

Общий механистический фон, на котором стоят вышеперечисленные конкретные оси:

• Адаптивные иммунные клетки несут автономные молекулярные часы (Bmal1, Clock, Per1/2, Cry1/2), задающие суточную осцилляцию трафика T/B-лимфоцитов, антиген-отзывчивости и судьбы CD4 Th1/Th2/Th17/Treg через mTOR/Akt и RORγt/Nfil3, синхронизируемые ритмичными глюкокортикоидными/катехоламиновыми сигналами — субстрат для time-of-day эффекта ICI [41415271].
• Миелоидные клетки (включая MDSC и TAM, центральные для PD-L1-опосредованной иммуносупрессии) обладают собственными часами, чей контроль метаболизма и митохондриальной динамики формирует антиген-презентацию и эффекторную функцию, с явной релевантностью к оптимизации тайминга иммунотерапии [40585526].
• Обзорный контекст CRC: ядро clock-генов (BMAL1, CLOCK, PER1/2/3, CRY1/2) оркеструет клеточный цикл, EMT, метаболическое перепрограммирование и TME при колоректальном раке — но CRC-специфичный циркадный контроль иммунного TME остаётся в основном инференциальным, а не чекпоинт-механистическим [41595646].
• Обзорный контекст РМЖ: циркадный контроль hallmarks рака молочной железы связывает misalignment/ночные смены с канцерогенезом и картирует петли обратной связи clock-генов на опухолевую биологию — устанавливая контекст, в котором чекпоинт/PD-L1-специфичные механизмы РМЖ остаются тонкими за пределами оси CLOCK → NF-κB → PD-L1 [42101677].

Пробелы/неопределённости

• HCT116: ни одно проверенное исследование не изучает напрямую циркадный/BMAL1/CLOCK-гейтинг PD-L1 (CD274) в клетках HCT116. Колоректальные циркадно-PD-L1 доказательства существуют только на мышиной генетической CRC [38806707] и в Bmal1⁻/⁻ колит-ассоциированной CRC [33652118], но не в HCT116.
• MDA-MB-231: нет прямого теста манипуляции ядром часов (BMAL1 или CLOCK) на PD-L1 в MDA-MB-231; единственная связь — непрямая, через мелатонин/FAK [41799764].
• Прямая оккупация промотора: прямое связывание CLOCK/BMAL1 с E-box промотора CD274 не показано ни в одной линии молочной железы или толстой кишки. Механизм в РМЖ непрямой (CLOCK → ацетилирование NF-κB p65 K56 → PD-L1, MCF7 [41261416]); единственное продемонстрированное связывание clock-фактора с промотором CD274 (RORA/HDAC3/DDX3X) — в меланоме [38718296].
• Ко-регуляция гликолиза и PD-L1: прямая связь нокдауна BMAL1 с одновременным ростом гликолиза и PD-L1 в HCT116 или MDA-MB-231 не показана; циркадно-гликолитически-иммуносупрессивная ось документирована лишь в целом и в желудочных M-MDSC через PER2 [41928364].
• Клинический тайминг: доказательства тайминга ICI доминируются лёгочными/меланомными/смешанными когортами [42316066; 42084869; 42134900]; РМЖ- или CRC-специфичных рандомизированных или эмулированных time-of-day ICI-исследований не выявлено.
• Пан-раковая работа 2026 г., явно связывающая структуру clock-генов с PD-L1 по нескольким типам рака, помечена как WITHDRAWN и без PMID — исключена как ненадёжная; таким образом, пан-раковое утверждение о clock-PD-L1 сцеплении сейчас не имеет цитируемого первичного источника.

Обратная дуга ERα ↔ часовой механизм и роль часов в эндокринной резистентности MCF7

Раздел про MCF7 фиксирует утрату осцилляции ESR1, но опускает обратное плечо (ER, управляющий часовыми генами; эстроген, сбрасывающий часы) и терапевтический ракурс эндокринной резистентности. Ниже — верифицированная доказательная база по механизмам.

1. Прямая обратная дуга «ER → часовой ген» в ERα-позитивных клетках рака молочной железы

Наиболее чёткое доказательство того, что ERα транскрипционно управляет ядром часов, получено для гена CLOCK: при стимуляции 17β-эстрадиолом (E2) ERα связывается с эстроген-респонсивными элементами (ERE) промотора CLOCK, повышая мРНК и белок CLOCK, а нокдаун CLOCK снижает пролиферацию — то есть это плечо ER→часы про-пролиферативно [24789043]. Важная оговорка по специфичности линии: в реферате указаны «ERα-позитивные линии рака молочной железы» (MCF7 фигурирует в полном тексте, а не в реферате), поэтому строго «в самой MCF7» подтверждён механизм, но именование линии — деталь полного текста [24789043].

Обратно направленное плечо «часы → ER» также задокументировано в ERα+ клетках (модель MCF-7 и T47D): белок CLOCK физически взаимодействует с ERα (взаимодействие усиливается эстрогеном) и подвергается SUMOylation по K67/K851 (SUMOylation тоже стимулируется эстрогеном); SUMO-CLOCK повышает как собственную транскрипционную активность CLOCK, так и CLOCK-опосредованную транскрипционную активность ERα, что ведёт к росту транскрипции cyclin D1 и стимуляции клеточного роста/доли S-фазы [23160374].

Реципрокная отрицательная обратная связь замыкается через PER2: эстроген индуцирует Per2, а PER2, в свою очередь, связывает ERα и усиливает его деградацию (подавление PER2 стабилизирует ERα) — механизм ослабления эстрогенового сигнала; сверхэкспрессия PER2 в клетках рака молочной железы вызывает выраженное подавление роста, потерю клоногенности и апоптоз [17599055]. В реферате использована формулировка «ERα-позитивные клетки рака молочной железы»/«these cells» — прямое именование MCF7 в реферате отсутствует.

Дополнительный узел «гормон → часы» — фактор KLF9: дизрегулированный эстрогеновый (E2) и глюкокортикоидный сигналинг перестраивают локальный молочный осциллятор через KLF9, причём KLF9 подтверждён как прямая мишень глюкокортикоидного рецептора и точка перекрёста гормонального и циркадного контуров; форсированная экспрессия KLF9 меняет базовую и E2/GC-зависимую экспрессию часовых генов, а нокдаун/сверхэкспрессия KLF9 меняют фенотипы — данные получены прямо в MCF7 (а также MCF10A и MDA-MB-231) [36823570]. Оговорка: реферат подтверждает прямую мишень глюкокортикоидного входа и функциональную регуляцию часов через KLF9, но не заявляет KLF9 прямой мишенью самих часовых (E-box) факторов.

2. ERα как организатор часового контура в нормальном эпителии — и утрата осцилляции ESR1 при малигнизации (происхождение тезиса раздела)

В нормальном ERα-позитивном эпителии молочной железы ERα поддерживает эстроген-регулируемый контур PER2–BMAL1, необходимый для ацинарного морфогенеза; при этом мРНК ERα сама осциллирует циркадно. Нокдаун ERα нарушает осцилляцию PER2–BMAL1 и формирование 3D-ацинусов, а нокдаун PER2 или BMAL1 нарушает циркадную осцилляцию ERα — то есть контур двунаправлен. Показано в клетках HME1 (нормальный эпителий), не в MCF7; и осцилляция ERα, и контур утрачиваются в клетках рака молочной железы независимо от ER-статуса [22935699].

Это же явление показано методом захвата ритма (serum shock): в культивируемых нормальных эпителиальных клетках молочной железы после сывороточного шока внутренние часы работают и ERα мРНК осциллирует циркадно, тогда как и ERα-положительные, и ERα-отрицательные линии рака молочной железы теряют внутренние часы, а ER+ раковые клетки — ещё и циркадную осцилляцию ERα [22193044]. Прямо в MCF7: в стандартной культуре осцилляции нет; сывороточный шок индуцирует осцилляцию часовых/часо-контролируемых генов в неопухолевой MCF-10A, но эта осцилляция репрессирована/нарушена в MCF-7; мелатонин по-разному модулирует Bmal1 и Per2 в двух линиях, а ксенотрансплантация MCF-7 в циркадно-компетентного хозяина восстанавливает периферические часовые ритмы опухолевых клеток — то есть часовой дефект MCF7 частично обратим системными (в т.ч. гормональными) сигналами [23012497].

3. Популяционные и клинические корреляты: ER-статус и сохранность часовой программы

На уровне популяции ER+ состояние несёт более сохранную часовую программу. В TCGA-BRCA (n=1119) экспрессия CRY1, PER1, PER2, PER3, BMAL1 (ARNTL), CLOCK, RORA, RORB, RORC, NR1D1, NR1D2 и FBXL3 выше в ER+ опухолях, чем в ER−, что согласуется с тем, что ER поддерживает экспрессию часовых генов в масштабе популяции [39193850]. В когорте из 766 узел-негативных, системно не леченных опухолей более высокая экспрессия часовых генов ассоциирована с более длинной безметастатической выживаемостью, причём прогностические гены субтип-специфичны: PER1, PER3, CRY2, NFIL3 — именно в ER+/HER2− (эндокрин-чувствительной) подгруппе, что привязывает утрату часовых генов к прогрессии конкретно в эндокрин-чувствительном субтипе [25485508]. В luminal A (ER+) опухолях сохраняются приглушённые, перепрограммированные ритмы; при этом контринтуитивно высокая глобальная сила ритма (CYCLOPS magnitude) ассоциирована с усиленным циклированием EMT-генов, большей инвазивностью и сниженной 5-летней выживаемостью, а нарушение молекулярных часов снижает инвазию luminal A в 3D-культуре [38319971]. Оговорка: циркадная модуляция путей эстрогеновой чувствительности в этой работе задокументирована в неопухолевой ткани молочной железы, тогда как luminal A опухоли демонстрируют сохранённые, но приглушённые/перепрограммированные ритмы [38319971].

Человеческое подтверждение того, что гены рецепторов эстрогена ведут себя как циркадно-контролируемые: у медсестёр дневной смены наблюдаются 24-часовые ритмы BMAL1, PER2, PER3 и ESR2 с нормальной инверсной связью PER2–BMAL1, тогда как ночная сменная работа нарушает эти ритмы, устраняет ритмичность ESR2 и разрушает антифазную связь PER2:BMAL1 в PBMC [38837828]. Оговорка по специфичности: ритмичным в реферате показан именно ESR2; ритм ESR1 в реферате не продемонстрирован.

4. Эстроген как входной/сбрасывающий сигнал для периферических часов (обобщённые механизмы; НЕ в MCF7)

Что эстроген может выступать прямым сбрасывающим/фазосдвигающим сигналом для периферических часов, показано вне MCF7 — преимущественно в репродуктивных тканях грызунов. E2 укорачивает период осцилляций PER2::LUCIFERASE в эксплантированной матке, но НЕ в SCN, и SERM ралоксифен блокирует этот эффект — механистическое доказательство ER-опосредованного сброса периферических (репродуктивных) часов [18728223]. Хронический E2 перепрограммирует часовые ритмы тканеспецифично in vivo: сдвигает пик Per2 в SCN вперёд, задерживает фазу и повышает амплитуду Per1 в печени/почке и порождает бифазные ритмы Per1/Per2 в матке [16273538]. Овариальные стероиды дают обратную связь на периферические часы: ритмы Per1, Per2, Bmal1 меняются по эстральному циклу в матке/яичнике in vivo, а экзогенные эстроген и прогестерон меняют ритмы PER2::LUC в культивируемой матке [20096720]. В беременной матке растущий эстрадиол повышает амплитуду осцилляций PER2::LUCIFERASE (в присутствии прогестерона), а BMAL1 повышает транскрипцию Ptgs2/COX-2 для синтеза PGE2 — двунаправленное гормон-часовое сопряжение [33554778]. На общеклеточном уровне метод одноклеточных фазовых кривых (Circa-SCOPE) выделяет рецепторы стероидных гормонов, включая рецепторы половых гормонов, как ключевых медиаторов индуцированного сывороткой сброса часов, действующих в значительной мере через CRY2 — что механистически обосновывает гормоны как переносимые кровью сбрасывающие сигналы [41354650].

Важная контр-нюансировка против бланкетного тезиса «эстроген синхронизирует часы»: в эндометриальных стромальных клетках матки крысы синхронизирует осциллятор Per2-dLuc прогестерон, но НЕ эстрадиол; эстрадиол сам по себе не сбрасывал эти клетки [19096762]. Тот же контраст воспроизводится и в клеточной модели: в MCF-7 прогестерон, но не эстроген, остро повышал Per1, Per2, Bmal1 [20096720]. Таким образом синхронизирующая роль эстрогена тканеспецифична и контекст-зависима, и её нельзя автоматически переносить на MCF7.

5. Часы и тамоксифен/эндокринная резистентность — прямые данные в MCF7

Циркадно-мелатониновая дизрегуляция управляет тамоксифен-резистентностью: тусклый свет ночью (dLEN) подавляет ночной мелатонин и придаёт ERα+ MCF-7 ксенографтам ВНУТРЕННЮЮ резистентность к тамоксифену (ускоренный рост, повышенный метаболизм опухоли, активация про-онкогенного тирозинкиназного сигналинга), тогда как ночной мелатонин восстанавливает чувствительность к тамоксифену и вызывает регрессию [25062775]. Фармакологическая модуляция часов ресенситизирует ER+ рак: синтетический ингибитор криптохрома KS15 дерепрессирует E-box-опосредованную транскрипцию, замедляет рост MCF-7 и повышает химиочувствительность к доксорубицину и тамоксифену, не влияя на неопухолевую MCF-10A [26407844]. Воздействие на плечо REV-ERB антипролиферативно: синтетический агонист REV-ERBα/β SR9011 подавляет пролиферацию линий рака молочной железы (включая ER+ MCF-7 и T47D), щадя MCF-10A, репрессируя cyclin A (CCNA2) и приостанавливая клеточный цикл до M-фазы (ген NR1D1 соседствует с ERBB2/HER2) [26074263]. Оговорка: в реферате SR9011 подавляет пролиферацию «независимо от ER или HER2 статуса», то есть эффект не является ER-специфичным. Наконец, бифункциональные конъюгаты мелатонин-тамоксифен, одновременно связывающие ESR1 (антагонист) и мелатониновый рецептор MT1 (агонист), ингибируют жизнеспособность и миграцию ТАМОКСИФЕН-РЕЗИСТЕНТНЫХ MCF-7 — стратегия оси часы/мелатонин, прямо нацеленная на преодоление тамоксифен-резистентности [31221824].

Пробелы/неопределённости

• Прямая ERα-ChIP-демонстрация ERE-регуляции промотора BMAL1/ARNTL в MCF7 отсутствует. ER→ядро-часов ERE-доказательство в ERα+ линиях есть для CLOCK [24789043], тогда как ER-управляемый контур PER2–BMAL1 показан в эпителии HME1 [22935699], а не в MCF7 — поэтому прямое транскрипционное плечо ERα→BMAL1 именно в MCF7 не доказано.
• Нет первичной работы, где манипуляция ядерным часовым геном (BMAL1, PER2, CRY) КАУЗАЛЬНО придаёт или снимает тамоксифен/фулвестрант/ингибитор-ароматазы резистентность в MCF7. Доказательства эндокринной резистентности организменные/мелатонин-опосредованные [25062775] или через CRY-ингибиторную химиосенситизацию [26407844]; клеточно-автономный механизм «часовой ген → эндокринная резистентность» в MCF7 остаётся открытым.
• Не показано, что эстрадиол напрямую синхронизирует/сбрасывает клеточные часы самой MCF7 (как E2 делает в матке грызунов). Данные «эстроген как синхронизатор» — в матке/SCN грызунов [18728223, 16273538, 20096720, 33554778] и в общем сывороточно/стероидном сбросе через CRY2 [41354650], но не в MCF7. Более того, есть прямая контр-нюансировка: прогестерон, а не эстрадиол, синхронизировал стромальный осциллятор матки [19096762], а в MCF-7 клок-гены остро поднимал прогестерон, не эстроген [20096720] — потенцию эстрогена как одиночного синхронизатора не следует переобобщать на MCF7.
• Реального одноклеточного репортёрного time-course осцилляции ESR1/ERα именно в MCF7 нет; «утрата осцилляции ESR1» выведена из популяционных/эпителий-vs-рак сравнений [22193044, 22935699], а не из прямой ESR1-люциферазной записи в MCF7.
• Нет первичных данных MCF7 по часовому контролю ароматазы (CYP19A1) / ритмическому локальному синтезу эстрогена — правдоподобная, но неисточённая связь между часами и внутриопухолевым синтезом эстрогена.
• Именование линии: для ключевого ERE→CLOCK доказательства [24789043] и PER2↔ERα контура [17599055] рефераты используют формулировку «ERα-позитивные клетки рака молочной железы»; конкретно MCF7 подтверждается полным текстом, не рефератом.

Взаимодействие циркадианных часов с сигнальным путём Wnt/β-catenin в HCT116 и колоректальном канцерогенезе

1. Реципрокная петля PER2 ⇄ β-catenin: прямые данные в HCT116 и её пределы

Наиболее прямое доказательство того, что часовой ген помещается выше β-catenin в клетках колоректального рака, дано на самой линии HCT116: нокдаун PER2 методом RNAi в HCT116 (и параллельно в SW480) повышает уровень β-catenin, cyclin D и пролиферацию, а совместное подавление β-catenin отменяет прирост cyclin D и пролиферации — что ставит PER2 функционально выше β-catenin [19010825]. Тот же источник in vivo показывает, что мыши Per2(m/m) демонстрируют дерегуляцию c-Myc и cyclin D, а при скрещивании с Apc(Min/+) образуют вдвое больше кишечных и толстокишечных полипов [19010825]. Это единственная работа, надёжно закрывающая ось PER2 → β-catenin непосредственно в HCT116.

Обратное плечо петли (β-catenin → деградация PER2) продемонстрировано не в HCT116, а на слизистой кишечника мышей Apc(Min/+): повышенный β-catenin дестабилизирует белок PER2, индуцируя β-TrCP (F-box-компонент SCF-убиквитинлигазы E3), и в слизистой Apc(Min/+) падение PER2 сопровождается нарушением ритмов Per1/Per2 и контролируемых часами генов Dbp и Wee1 [19106159]. Таким образом, полная реципрокная петля β-catenin → β-TrCP → PER2 собрана из мышиной модели ApcMin, а не из самой линии HCT116 — важное ограничение при переносе схемы на HCT116.

2. Нарушение часов → Apc LOH → гиперактивация Wnt / c-Myc / гликолиз (органоиды, не HCT116)

На уровне модели инициации опухоли генетическое и средовое (фотопериодическое) нарушение циркадианных часов ускоряет Apc-зависимый канцерогенез, причём в кишечных органоидах нарушение часов запускает потерю гетерозиготности Apc (Apc LOH), гиперактивирующую Wnt-сигналинг, повышающую Wnt-мишень c-Myc и усиливающую гликолитический метаболизм; в органоидах, полученных от пациентов, циркадианные ритмы утрачены, а дисперсия между генами часов и Wnt-пути значимо предсказывает выживаемость при CRC [35947664]. Это ключевое механистическое звено clock→Apc→Wnt→c-Myc получено на органоидах и мышах, но не на HCT116.

3. BMAL1 в CRC: противоречивое направление внутри той же линии HCT116

Данные по BMAL1 в HCT116 внутренне противоречивы, и это следует излагать как неразрешённое противоречие, а не как консенсус.

Онкогенная / прометастатическая ветвь (прямо в HCT116): сверхэкспрессия BMAL1 в HCT116 (по данным полного текста — также RKO и SW480; в самом абстракте линии названы обобщённо как «CRC cell lines») усиливает пролиферацию, миграцию и EMT за счёт высвобождения β-catenin, что через путь MAPK повышает онкоген c-Myc; блокада ERK1/2 и JNK и сайленсинг BMAL1 дают противоположный эффект — оси BMAL1 → β-catenin → c-Myc [36806631]. Дополнительно BMAL1 стимулирует метастазирование, транскрипционно повышая Rab27a и секрецию проонкогенных экзосом: в HCT116 и SW620 повышение BMAL1 усиливает, а нокдаун снижает промиграционный экзосомный выход [34727291]. В том же проонкогенном ключе нокдаун BMAL1 в HCT116 и SW480 смещает эпителиально-мезенхимальный баланс в сторону эпителия (рост E-cadherin/CK-20/EpCAM; падение Twist, N-cadherin, vimentin), снижая инвазию и химиорезистентность, а GSEA связывает высокий BMAL1 у пациентов с EMT/инвазивными сигнатурами — то есть высокий BMAL1 здесь проинвазивен [34065633].

Опухоль-супрессорная / химиосенсибилизирующая ветвь (тоже с участием HCT116): сверхэкспрессия BMAL1 в HCT116 (а также HT29 и THC8307) подавляет пролиферацию и повышает чувствительность к оксалиплатину in vitro и в ксенографтах HCT116 через ATM-зависимый G2–M-арест; клинически высокий опухолевый BMAL1 предсказывает более длинную общую и безрецидивную выживаемость [24277452]. Фармакологическое усиление ритмичности (dexamethasone, forskolin, тепловой шок) в HCT-116 восстанавливает осцилляцию генов часов и клеточного цикла и смещает клетки из S-фазы в G1, замедляя пролиферацию [28196531]; при этом доказательство «часо-внутренней» природы эффекта (отмена ростового эффекта нокдауном Bmal1) получено на меланоме B16, а HCT-116 воспроизвела лишь сдвиг S→G1 и замедление роста — то есть строгая Bmal1-зависимость именно в HCT116 в этой работе не показана [28196531]. На уровне контекстной зависимости нокдаун BMAL1 в HCT116 (дикий p53) вызывает первичную волну апоптоза, после которой выжившие клетки имеют сниженный P53, но повышенную активацию AKT/mTOR и рост пролиферации, причём ответ клеточно-специфичен между HCT116, SW480 и SW620 — то есть эффект часов не универсален [32388500]. Опухоль-супрессорная роль подтверждается и на других моделях: потеря эпителиального Bmal1 (или сбой фотопериода) увеличивает инициацию опухолей в модели Apc(min), а нокаут Bmal1 повышает самообновление кишечных стволовых клеток YAP1-зависимым образом; примечательно, что часо-нарушенные опухоли Apc(min) показывают ВЫСОКУЮ активность YAP/Hippo при НИЗКОЙ активности Wnt — то есть эта супрессорная роль BMAL1 не Wnt-опосредована [34534703]. В мышиных клетках C26 (и L929) нокдаун Bmal1 ускоряет пролиферацию и рост опухоли, снижает Per1/2/3, wee1 и p53, изменяет c-myc и cyclin D1, повышает cdc2/cyclin B1/D1/E и ослабляет апоптоз и повреждение ДНК от химиопрепаратов — связывая потерю BMAL1 с дерегуляцией c-Myc/циклинов и химиорезистентностью [20576619].

Итог по BMAL1: и онкогенное (36806631, 34727291, 34065633), и супрессорное/химиосенсибилизирующее (24277452, 28196531, 34534703) направление получены с участием HCT116 или близких моделей; ни одна работа не примиряет эту стадийно-контекстную зависимость механистически именно в HCT116.

4. PER3 → β-catenin/Notch в стволоподобных клетках HCT-116

В сферообразующих колоректальных стволоподобных клетках, обогащённых из HCT-116, сверхэкспрессия PER3 снижает самообновление и 5-FU-химиорезистентность и понижает Notch1, Jagged1, β-catenin, c-Myc и LGR5, тогда как нокдаун PER3 даёт обратное; ингибирование β-catenin (или Notch) воспроизводит антистволовой эффект, что помещает PER3 выше осей β-catenin/Notch [27983919]. Это второй (после PER2) часовой ген с прямым β-catenin-читаемым фенотипом именно в HCT-116.

5. Прямая манипуляция генами часов в HCT116 через узел MACC1

Нокаут/нокдаун ARNTL(BMAL1), PER2 или NR1D1 в HCT116, SW480 и SW620 изменяет пролиферацию и инвазию через реципрокное (двунаправленное) взаимодействие с драйвером метастазирования MACC1, включая белок-белковое взаимодействие MACC1–NR1D1 и циркадианную экспрессию MACC1 в HCT116 [35884519]. Это прямая манипуляция ядерными часовыми генами в HCT116, но она замыкается на MACC1, а не на канонический Wnt/β-catenin/APC-узел.

6. Обратное плечо (β-catenin → ядро часов) в колоректальных клетках — показано в SW480, не в HCT116

Циркадианное нарушение (постоянный свет) дерегулирует β-catenin и белки плотных контактов; в клетках SW480 сайленсинг β-catenin нарушает барьерную функцию И действует как вышестоящий регулятор ядерных часовых генов Bmal1, Clock и Per1/2, одновременно повышая MMP-2/MMP-9 [35976519]. Это второе реципрокное плечо (β-catenin → часы) в колоректальной линии, но продемонстрировано оно в SW480, а не в HCT116.

7. Wnt как нишевый вход в часы стволовой клетки и сопряжение часы–клеточный цикл

Секретируемый Paneth-клетками WNT обеспечивает межклеточное сопряжение, гейтирующее циркадианные часы к клеточному циклу в мышиных 3D-энтероидах, синхронизируя деления ISC/прогениторов; ингибирование секреции WNT разрывает это сопряжение [27867006]. В кишечнике Drosophila сигнальные пути Wnt и Hippo положительно регулируют функцию часов кишечных стволовых клеток, а функция часов снижается при энтероэндокринной дифференцировке — то есть Wnt выступает вышестоящим нишевым входом в часы ISC (направление, комплементарное clock→Wnt) [30428387]. Оба результата — не на HCT116 и не в опухолевом контексте.

8. c-Myc как циркадианный выход в раке толстой кишки

У мышей-опухоленосителей контролируемый часами онкоген c-MYC ритмически активирует транскрипцию рецептора трансферрина 1 (TfR1), что показано люциферазным репортёром и ChIP, давая 24-часовой ритм TfR1, пригодный для тайминга доставки оксалиплатина [20631077]. Это прямое свидетельство того, что c-Myc функционирует как циркадианный выход в раке толстой кишки — но узел клетки здесь мышиный (colon26-подобная модель), а ChIP выполнен по промотору TfR1, а не по промотору MYC.

9. Смежная ось NDRG2–CLOCK–FGF2

Опухолевый супрессор NDRG2 стабилизирует ядерный часовой белок CLOCK (блокируя STUB1-опосредованное и способствуя USP8-опосредованному деубиквитинированию); ось NDRG2–CLOCK транскрипционно репрессирует FGF2, повышая чувствительность к оксалиплатину, а кишечный нокаут Ndrg2 усугубляет вызванный циркадианным нарушением колоректальный канцерогенез [42156989]. Это недавняя (2026) циркадианно-CRC-ось, примыкающая к сети Myc/часы, но не затрагивающая β-catenin/APC напрямую.

10. Обзорный синтез

Обзорная работа резюмирует, что белки часов CLOCK1, BMAL1, PER и CRY влияют на пути c-Myc/p21 и Wnt/β-catenin и на ответ на повреждение ДНК, а экспрессия часовых генов коррелирует с патогенезом, прогрессией, агрессивностью и прогнозом CRC (высокий BMAL1 связан со снижением общей выживаемости; сниженные PER2/PER3 — с худшей дифференцировкой и прогнозом) [24587674]. Это каноническая формулировка того, что циркадианно-Wnt/c-Myc-кроссток для CRC считается установленным — но как обзор, а не как первичное HCT116-доказательство.

Пробелы/неопределённости

• HCT116 генетически особенная, и это нигде не адресовано. HCT116 — линия с мутацией CTNNB1 (β-catenin, exon 3) и диким APC, тогда как SW480/ApcMin — APC-мутантные. Ни одна из HCT116-работ по PER2/BMAL1/β-catenin (19010825, 36806631, 27983919) не обсуждает, что Wnt-выход HCT116 обусловлен CTNNB1, а не потерей APC; целенаправленный поиск, связывающий CTNNB1-драйверную активацию Wnt в HCT116 с генами часов, дал ноль публикаций.
• Нет прямой оси PER2/BMAL1 → APC в HCT116. Влияние часов на APC выведено только из моделей Apc(Min) и органоидов (19010825, 34534703, 35947664); HCT116-механизм идёт через β-catenin/β-TrCP и c-Myc, а не через сам APC.
• Направление BMAL1 в HCT116 не разрешено — супрессор/химиосенсибилизатор (24277452, 28196531, 34534703) против онкогена/прометастатического фактора (36806631, 34727291, 34065633); стадийно-контекстная зависимость нигде не примирена механистически именно в HCT116.
• Нет HCT116-специфичного ChIP/оккупансии промотора MYC для PER2 или BMAL1. c-Myc многократно назван точкой конвергенции Wnt/часов, но в HCT116 доказательства косвенные (через высвобождение β-catenin в 36806631), а прямое связывание PER2/BMAL1 с промотором MYC в HCT116 не показано.
• Нет прямых HCT116-данных, связывающих CRY1/CRY2 с Wnt/β-catenin.
• Обратное плечо (β-catenin → часы) в самой HCT116 не показано — оно продемонстрировано в слизистой ApcMin (19106159) и в SW480 (35976519), из-за чего существование замкнутой петли обратной связи именно в модели HCT116 установлено лишь частично.

4. Ключевые сквозные темы

• «Часовая компетентность» — это градиент, задающий ответ на модуляцию, а не бинарь «есть/нет». Линии выстраиваются от функциональных HCT116 через демпфированный MCF7 к арритмичной MDA-MB-231, и амплитуда остаточного ритма прямо масштабирует эффект модуляторов часов: нобилетин восстанавливает ритм и сильно бьёт по онкопризнакам в арритмичной MDA-MB-231, но даёт лишь тонкий эффект в слабо-ритмичной MCF7 [32706791][31357909].

• Направление роли ядра часов контекст-зависимо и часто ПРО-онкогенно, вопреки догме «часы = супрессор». BMAL1 поддерживает EMT/секрецию экзосом в HCT116 [34065633][34727291], ASMT-поддерживаемые CLOCK/BMAL1/PER1 про-инвазивны в MDA-MB-231 [33194597], а ER→CLOCK-плечо про-пролиферативно в MCF7 [24789043] — «часы» не универсальный тормоз опухоли.

• p53-статус линии определяет, работает ли ось PER2–p53–MDM2 как узел, но её главная функция — не активация, а сдерживание. Стабилизированный PER2-связанный p53 транскрипционно «заперт» и притупляет генотоксический ответ в HCT116(p53+/+)/H1299 [25103245][25411341]; в p53-mut MDA-MB-231 этот модуль выпадает.

• Метаболический кросс-ток сходится на трёх воротных ферментах — PDK1, SLC7A11 и на балансе ферроптоза — но линие-специфично. CRY→PDK1 в MDA-MB-231 (Варбург) [38199564] и ARNTL2→SLC7A11 в CRC (антиферроптоз, 5-FU-резистентность) [40753759] — две независимые ветви одной темы «часы → метаболический воротный фермент → выживание/резистентность».

• Многие оси установлены как чистая биохимия в инструментальных/модельных системах и лишь экстраполируются на опухоли. Геномный clock-цистром и Pol II — печень мыши [22936566][24591654]; MAPK→BMAL1(Thr534) — HEK293 [11687575]; GSK3β-узел PI3K/AKT — фибробласты/обзоры [20049328][33941065]; HIF/BMAL1-конкуренция — нейробластома/миотубы [41362097] — ни один из этих механизмов не воспроизведён прямо в HCT116/MDA-MB-231/MCF7.

• Парадокс адресности драйвера: линии с онкогенным KRAS/PIK3CA не там, где показан соответствующий clock-crosstalk. HCT116 несёт KRAS+PIK3CA, но прямых clock↔ERK и clock↔PI3K/PIP3 экспериментов в ней нет; прямое MAPK→часы получено в «нейтральной» HEK293 [11687575] — очевидная точка для целевых экспериментов.

• MCF7 — это в первую очередь история ER-часового реципрокного контура, а не Warburg/HIF. Прямые промотор-уровневые узлы (ERα⇄CLOCK, PER2→деградация ERα, CLOCK→p65→PD-L1) [24789043][23160374][17599055][41261416] делают MCF7 моделью гормон-часового кросс-тока и эндокринной резистентности, а не метаболизма.

• Clock-ассоциированные, но не-TTFL гены (TIMELESS–TIPIN, FEN1) и REV-ERB-фармакология связывают часы с репликативным стрессом/DDR и цитотоксичностью независимо от осцилляции. REV-ERB-агонисты SR9009/SR9011 летальны для опухолевых клеток независимо от p53 и гипоксии [29320480]; FEN1-KD в HEK293T рушит осциллом и вход в S-фазу [41980678].

5. Открытые вопросы и пробелы литературы

• Есть ли прямой clock↔HIF1α эксперимент в HCT116 или в линиях РМЖ? Вся молекулярная основа (общие bHLH-PAS-партнёры, неканоническая HIF/BMAL1-гетеродимеризация, реципрокная BMAL1/CRY ⇄ HIF1α) [35695677][41362097][41362097] получена на нейробластоме/миотубах/фибробластах — прямого доказательства в фокусных опухолевых линиях нет, при том что и CRC, и TNBC клинически гипоксичны.

• Почему clock↔RAS/ERK не проверен в KRAS-mut HCT116 и BRAF/KRAS-контексте MDA-MB-231? Единственное прямое MAPK→BMAL1(Thr534) — в HEK293 [11687575]; влияние конститутивно активного онкогенного RAS на часы именно в этих линиях остаётся открытым — вероятная высоколевереджная точка.

• Существует ли полногеномный clock-цистром (CLOCK:BMAL1 ChIP-seq + Pol II) хотя бы в одной из четырёх линий? Сейчас весь геномный уровень — печень мыши [22936566][24591654]; неизвестно, воспроизводятся ли неканонические E-box и pioneer-подобное ремоделирование в человеческом опухолевом хроматине.

• PI3K/PIP3/AKT ↔ часы в PIK3CA-mut HCT116: узел GSK3β и весь PI3K-crosstalk документированы на фибробластах/печени/обзорах [38336976][33941065][20049328] — прямого теста в идеально подходящей PIK3CA-mut линии нет.

• Каков полный метаболический фенотип часов в MCF7? Для люминальной ER+ линии нет прямых данных по Варбургу/липогенезу/NAD-SIRT1; melatonin–BMAL1–ALDH3A1 линию не называет [41228459] — приписать результат MCF7 нельзя.

• Работает ли ось «часы→ферроптоз» в линиях РМЖ? Прямые первичные работы существуют только в CRC-контексте (ARNTL2–SLC7A11) [40753759][39268727]; для MDA-MB-231/MCF7 оси «часы→GPX4/ACSL4/SLC7A11» прямых данных нет — явный пробел.

• Насколько «HCT116-специфичны» результаты, где линия фигурирует лишь в полном тексте методов? Для ARNTL2–SLC7A11 [40753759], REV-ERB-агонистов [29320480] и ряда p53-узлов [25103245] именование HCT116 верифицируется по полному тексту, а не по реферату — требуется прямое подтверждение считываний именно в HCT116.

• Демпфированный (а не отсутствующий) ритм MCF7: какова функциональная цена низкой амплитуды — сохраняются ли фаза-зависимая химиочувствительность и circadian gating DDR/NER при демпфированном осцилляторе, или амплитудный порог их отключает? [31357909]

• Прямая оккупация CLOCK/BMAL1 на E-box промотора CD274 (PD-L1) не показана ни в одной линии РМЖ/CRC — в MCF7 связь непрямая (CLOCK→p65-ацетилирование) [41261416]; вопрос, есть ли прямой clock-элемент на чекпоинт-промоторах в целевых линиях, открыт.

• Обратное плечо петель, собранное из мышиных моделей, а не из линий: β-catenin → β-TrCP → PER2 показано в ApcMin-слизистой, не в HCT116 [19106159]; воспроизводимость обратной регуляции в самой линии не подтверждена.

Темы, помеченные критиком полноты как недостаточно покрытые в первичном проходе (часть закрыта в Части III):

• CK1δ/ε (CSNK1D/CSNK1E) phosphorylation of PER1/PER2 — the canonical period-setting and PER-degradation mechanism (FASP/degron, tau-mutant kinetics) and CK1 inhibitors (PF-670462, PF-480402, longdaysin) tested in HEK293 host assays and in HCT116/breast cancer proliferation: this core-clock kinase is absent even though the HEK293 section catalogues ERK, GSK3β, PPP4 and PCBP1 but never CK1.
• REV-ERBα/β agonists SR9009 and SR9011 as direct anticancer cytotoxic agents in HCT116 colorectal and breast cancer cells (Kojetin/Sulli lethality via de novo lipogenesis and autophagy blockade), versus the antagonist SR8278 — the metabolism/MYC sections mention SR8278 and REV-ERB biology but omit the pharmacological REV-ERB-as-drug-target evidence in the named lines.
• TIMELESS (TIMELESS–TIPIN) and its replication/DDR role in MDA-MB-231, MCF7 and HCT116 — TIMELESS overexpression, replication-fork protection, ATR/CHK1 activation and prognostic value in breast and colorectal cancer, a clock-associated gene entirely missing from the PER/CRY/BMAL1-focused DDR and cell-line sections.
• Circadian gating of nucleotide-excision repair (XPA/ERCC1) and platinum/oxaliplatin chrono-sensitivity in HCT116 colorectal cells (Sancar clock–DNA-repair axis) plus chronomodulated chemotherapy timing — the DDR section covers FEN1 in HEK293T but not the canonical clock-controlled DNA-repair/platinum-toxicity link most relevant to HCT116 chemosensitivity.
• Circadian clock control of ferroptosis (BMAL1/ARNTL and PER regulation of GPX4, ACSL4, SLC7A11 and lipid peroxidation) in HCT116 / MDA-MB-231 / MCF7 — a major regulated-cell-death axis with growing clock literature that is completely absent from the metabolism and apoptosis coverage.
• BMAL1/clock gating of PD-L1 (CD274) and antitumor immunity in breast and colorectal cancer — circadian control of immune-checkpoint expression and immunotherapy timing, beyond the single PER2→M-MDSC gastric note, with direct MDA-MB-231/HCT116 relevance largely uncovered.
• Reciprocal ERα (ESR1)–BMAL1 regulation, estrogen as an entraining signal, and clock involvement in tamoxifen/endocrine resistance in MCF7 — the MCF7 section documents loss of ESR1 oscillation but omits the reverse arm (ER driving clock genes; estrogen resetting the clock) and the therapeutic endocrine-resistance angle.
• Circadian clock crosstalk with Wnt/β-catenin (PER2, BMAL1 and APC/β-catenin/c-Myc) in HCT116 and colorectal tumorigenesis — the dominant CRC driver pathway is absent despite well-documented PER2–β-catenin and BMAL1–Wnt interactions directly pertinent to the HCT116 model.
• WEE1/CHK1/CDK1 circadian gating of the G2/M checkpoint and clinical chronomodulated chemotherapy trials (irinotecan/oxaliplatin/5-FU timing) in colorectal cancer — the cell-cycle section covers CLOCK/BMAL1→Cyclin B1 but omits WEE1/checkpoint-kinase timing and the human chronotherapy trial evidence that anchors clinical relevance.

6. Замечания по верификации: отброшенные утверждения

Утверждения, снятые на этапе состязательной верификации (PMID не подтверждал заявленное). Приведены для прозрачности.

Циркадианные часы в клетках колоректального рака HCT116 (KRAS/PIK3CA-mut, p53-wt): экспрес - Ни одна находка не отброшена: все 20 PMID разрешились в Europe PMC, заголовки полностью совпали, и аннотации подтверждают заявленный механизм и направление. - ПРИМЕЧАНИЕ по PMID 39134242 (сохранён, не отброшен): текст черновика утверждает, что онкогенные miRNA 'de-repress' (де-репрессируют) PTEN и p53 — это противоречит аннотации и собственному полю direction находки. Аннотация прямо говорит, что эти онкогенные miRNA ИНГИБИРУЮТ/снижают PTEN и p53 (а подавление PER2 дополнительно их снижает). Базовое, тематически релевантное утверждение (пол-смещённые oncomiR подавляют PER2/CRY2 и снижают PTEN/p53) аннотацией подтверждается, поэтому цитата оставлена, а механизм в тексте изложен корректно (снижение, а не де-репрессия).

Circadian clock disruption and clock-gene manipulation in MDA-MB-231 triple-negative (basa - PARTIAL DROP — PMID 39994450 (Mol Syst Biol 2025): citation RETAINED for verified content (four clock phenotypes functional/weak/unstable/dysfunctional; functional class = MCF10A + two luminal-A + two TNBC-BL1; clock strength shapes anti-cancer drug sensitivity; clock disruption line-specific, not uniformly TNBC — all confirmed in abstract + full-text XML PMC11965565). The finding's MDA-MB-231-specific sub-claim ('high-grade basal MDA-MB-231 lacks BMAL1/PER2 oscillations and falls in the dysfunctional-clock class') was DROPPED: neither the abstract nor the accessible full text assigns MDA-MB-231 to the dysfunctional class or states it lacks BMAL1/PER2 oscillations (the dysfunctional class comprises 'two cell models only', not named in text; the paper notes TNBC lines can show measurable rhythms). MDA-MB-231 arrhythmicity is instead sourced to PMID 32706791 and 41133664 in the write-up. - No whole findings were dropped for unresolved PMID or title mismatch: all 18 PMIDs resolved with matching titles, and every abstract (with full-text confirmation for PMID 23836662, 39994450, 41228459) supported its claim, except the single MDA-MB-231-specific sub-claim of 39994450 noted above.

Взаимодействие циркадных часов (BMAL1/CLOCK/PER2/CRY) и гипоксической сигнализации HIF-1α: - Ничего не отброшено: все 18 PMID разрешились в EuropePMC, названия совпали, абстракты поддерживают заявленные утверждения и направления. ПОПРАВКА (без отбрасывания цитаты) по PMID 32823749: в исходной находке сказано, что гены часов 'отрицательно ассоциированы с HIF-1alpha' — абстракт же прямо сообщает ПОЛОЖИТЕЛЬНУЮ корреляцию между HIF-1α и генами часов, тогда как с HbA1c отрицательно коррелируют оба; ключевое направление (скоординированное снижение и HIF-1α, и генов часов при СД2) поддержано, поэтому цитата сохранена, но в тексте отношение изложено корректно.

Часы, MYC и метаболические партнёры — репрессия молекулярных часов онкогенами MYC/MYCN (BM - c-MYC is Transcribed in a Circadian Manner and Acts as a Clock Disruptor whose Timing Minimizes its Impacts (clock→MYC direction / c-MYC oscillates anti-phase to BMAL1/PER2 in U2OS): DROPPED — no PMID. It is a non-peer-reviewed bioRxiv preprint (Europe PMC PMC13232071 / PPR1242049, 2026); Europe PMC returns the record but with PMID:None, so it cannot be entered as a verified peer-reviewed citation. The confirmed_citations set requires a resolvable PMID. The clock→MYC direction is retained only as a flagged uncertainty in the prose, not as a citation.

Источники (298)

Отсортировано по PMID. Инлайновые метки [PMID] в тексте соответствуют этому списку. Канонические заголовки/журналы — из NCBI.

• 10733524 — Involvement of the MAP kinase cascade in resetting of the mammalian circadian clock. Genes & development 2000. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10733524/
• 10848614 — Nuclear entry of the circadian regulator mPER1 is controlled by mammalian casein kinase I epsilon. Molecular and cellular biology 2000. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10848614/
• 10864977 — The basic helix-loop-helix-PAS protein MOP9 is a brain-specific heterodimeric partner of circadian and hypoxia factors. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 2000. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10864977/
• 11441146 — Regulation of clock and NPAS2 DNA binding by the redox state of NAD cofactors. Science (New York, N.Y.) 2001. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11441146/
• 11687575 — Mitogen-activated protein kinase phosphorylates and negatively regulates basic helix-loop-helix-PAS transcription factor BMAL1. The Journal of biological chemistry 2002. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11687575/
• 12150932 — The orphan nuclear receptor REV-ERBalpha controls circadian transcription within the positive limb of the mammalian circadian oscillator. Cell 2002. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12150932/
• 12372299 — The circadian gene Period2 plays an important role in tumor suppression and DNA damage response in vivo. Cell 2002. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12372299/
• 12691740 — Cross-talk between hypoxic and circadian pathways: cooperative roles for hypoxia-inducible factor 1alpha and CLOCK in transcriptional activation of the vasopressin gene. Molecular and cellular neurosciences 2003. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12691740/
• 12897057 — BMAL1-dependent circadian oscillation of nuclear CLOCK: posttranslational events induced by dimerization of transcriptional activators of the mammalian clock system. Genes & development 2003. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12897057/
• 14750904 — Phosphorylation of clock protein PER1 regulates its circadian degradation in normal human fibroblasts. The Biochemical journal 2004. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/14750904/
• 15298678 — Serine phosphorylation of mCRY1 and mCRY2 by mitogen-activated protein kinase. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms 2004. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15298678/
• 15767683 — Control of mammalian circadian rhythm by CKIepsilon-regulated proteasome-mediated PER2 degradation. Molecular and cellular biology 2005. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15767683/
• 15917646 — Circadian clock genes as modulators of sensitivity to genotoxic stress. Cell cycle (Georgetown, Tex.) 2005. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15917646/
• 15930378 — Light stimulates MSK1 activation in the suprachiasmatic nucleus via a PACAP-ERK/MAP kinase-dependent mechanism. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 2005. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15930378/
• 15972822 — A role for glycogen synthase kinase-3beta in the mammalian circadian clock. The Journal of biological chemistry 2005. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15972822/
• 15980066 — Ser-557-phosphorylated mCRY2 is degraded upon synergistic phosphorylation by glycogen synthase kinase-3 beta. The Journal of biological chemistry 2005. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15980066/
• 16267379 — Differential control of Bmal1 circadian transcription by REV-ERB and ROR nuclear receptors. Journal of biological rhythms 2005. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16267379/
• 16273538 — Estrogen differentially regulates expression of Per1 and Per2 genes between central and peripheral clocks and between reproductive and nonreproductive tissues in female rats. Journal of neuroscience research 2005. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16273538/
• 16484495 — Nuclear receptor Rev-erbalpha is a critical lithium-sensitive component of the circadian clock. Science (New York, N.Y.) 2006. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16484495/
• 16596306 — Tumor suppression by the mammalian Period genes. Cancer causes & control : CCC 2006. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16596306/
• 16678094 — Circadian regulator CLOCK is a histone acetyltransferase. Cell 2006. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16678094/
• 17476214 — Transcriptional coactivator PGC-1alpha integrates the mammalian clock and energy metabolism. Nature 2007. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17476214/
• 17592726 — Uncoupling of promoter methylation and expression of Period1 in cervical cancer cells. Biochemical and biophysical research communications 2007. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17592726/
• 17599055 — The clock gene Per2 links the circadian system to the estrogen receptor. Oncogene 2007. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17599055/
• 17909269 — Oligonucleotide microarray analysis of estrogen receptor alpha-positive postmenopausal breast carcinomas: identification of HRPAP20 and TIMELESS as outstanding candidate markers to predict the response to tamoxifen. Journal of molecular endocrinology 2007. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17909269/
• 18006707 — Rev-erbalpha, a heme sensor that coordinates metabolic and circadian pathways. Science (New York, N.Y.) 2007. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18006707/
• 18334030 — Period-2: a tumor suppressor gene in breast cancer. Journal of circadian rhythms 2008. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18334030/
• 18662546 — SIRT1 regulates circadian clock gene expression through PER2 deacetylation. Cell 2008. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18662546/
• 18662547 — The NAD+-dependent deacetylase SIRT1 modulates CLOCK-mediated chromatin remodeling and circadian control. Cell 2008. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18662547/
• 18728223 — Estrogen directly modulates circadian rhythms of PER2 expression in the uterus. American journal of physiology. Endocrinology and metabolism 2008. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18728223/
• 19010825 — Period 2 mutation accelerates ApcMin/+ tumorigenesis. Molecular cancer research : MCR 2008. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19010825/
• 19096762 — Progesterone, but not estradiol, synchronizes circadian oscillator in the uterus endometrial stromal cells. Molecular and cellular biochemistry 2009. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19096762/
• 19106159 — Beta-catenin induces beta-TrCP-mediated PER2 degradation altering circadian clock gene expression in intestinal mucosa of ApcMin/+ mice. Journal of biochemistry 2009. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19106159/
• 19164551 — Circadian oscillation of nucleotide excision repair in mammalian brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2009. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19164551/
• 19286518 — Circadian control of the NAD+ salvage pathway by CLOCK-SIRT1. Science (New York, N.Y.) 2009. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19286518/
• 19299583 — Circadian clock feedback cycle through NAMPT-mediated NAD+ biosynthesis. Science (New York, N.Y.) 2009. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19299583/
• 19833968 — AMPK regulates the circadian clock by cryptochrome phosphorylation and degradation. Science (New York, N.Y.) 2009. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19833968/
• 19861541 — Epigenetic inactivation of the circadian clock gene BMAL1 in hematologic malignancies. Cancer research 2009. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19861541/
• 19948962 — Essential roles of CKIdelta and CKIepsilon in the mammalian circadian clock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2009. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19948962/
• 20049328 — Regulation of BMAL1 protein stability and circadian function by GSK3beta-mediated phosphorylation. PloS one 2010. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20049328/
• 20096720 — Influence of the estrous cycle on clock gene expression in reproductive tissues: effects of fluctuating ovarian steroid hormone levels. Steroids 2010. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20096720/
• 20233725 — Tipin-replication protein A interaction mediates Chk1 phosphorylation by ATR in response to genotoxic stress. The Journal of biological chemistry 2010. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20233725/
• 20304803 — Circadian control of XPA and excision repair of cisplatin-DNA damage by cryptochrome and HERC2 ubiquitin ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2010. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20304803/
• 20576619 — Effects of the biological clock gene Bmal1 on tumour growth and anti-cancer drug activity. Journal of biochemistry 2010. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20576619/
• 20619819 — AKT and TOR signaling set the pace of the circadian pacemaker. Current biology : CB 2010. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20619819/
• 20631077 — Circadian rhythm of transferrin receptor 1 gene expression controlled by c-Myc in colon cancer-bearing mice. Cancer research 2010. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20631077/
• 20832105 — Poly(ADP-ribose) polymerase 1 participates in the phase entrainment of circadian clocks to feeding. Cell 2010. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20832105/
• 21113167 — The histone methyltransferase MLL1 permits the oscillation of circadian gene expression. Nature structural & molecular biology 2010. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21113167/
• 21193487 — Regulation of nucleotide excision repair activity by transcriptional and post-transcriptional control of the XPA protein. Nucleic acids research 2011. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21193487/
• 21393543 — A circadian rhythm orchestrated by histone deacetylase 3 controls hepatic lipid metabolism. Science (New York, N.Y.) 2011. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21393543/
• 22025708 — Control of skin cancer by the circadian rhythm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2011. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22025708/
• 22193044 — Entrainment of breast (cancer) epithelial cells detects distinct circadian oscillation patterns for clock and hormone receptor genes. Cell cycle (Georgetown, Tex.) 2012. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22193044/
• 22745214 — Sex moderates circadian chemotherapy effects on survival of patients with metastatic colorectal cancer: a meta-analysis. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology 2012. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22745214/
• 22918252 — Effect of circadian clock mutations on DNA damage response in mammalian cells. Cell cycle (Georgetown, Tex.) 2012. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22918252/
• 22935699 — Identification of an estrogen-regulated circadian mechanism necessary for breast acinar morphogenesis. Cell cycle (Georgetown, Tex.) 2012. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22935699/
• 22936566 — Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals. Science (New York, N.Y.) 2012. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22936566/
• 23012497 — Oscillation of clock and clock controlled genes induced by serum shock in human breast epithelial and breast cancer cells: regulation by melatonin. Breast cancer : basic and clinical research 2012. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23012497/
• 23127194 — Mitogen- and stress-activated protein kinase 1 modulates photic entrainment of the suprachiasmatic circadian clock. The European journal of neuroscience 2013. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23127194/
• 23160374 — CLOCK is a substrate of SUMO and sumoylation of CLOCK upregulates the transcriptional activity of estrogen receptor-α. Oncogene 2013. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23160374/
• 23728303 — Rev-Erbs repress macrophage gene expression by inhibiting enhancer-directed transcription. Nature 2013. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23728303/
• 23836662 — Loss of corepressor PER2 under hypoxia up-regulates OCT1-mediated EMT gene expression and enhances tumor malignancy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2013. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23836662/
• 24051248 — Circadian clock NAD+ cycle drives mitochondrial oxidative metabolism in mice. Science (New York, N.Y.) 2013. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24051248/
• 24051492 — p53 regulates Period2 expression and the circadian clock. Nature communications 2013. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24051492/
• 24161199 — Potential cancer-related role of circadian gene TIMELESS suggested by expression profiling and in vitro analyses. BMC cancer 2013. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24161199/
• 24262095 — Diverse roles for MAPK signaling in circadian clocks. Advances in genetics 2013. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24262095/
• 24277452 — Overexpression of the circadian clock gene Bmal1 increases sensitivity to oxaliplatin in colorectal cancer. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 2014. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24277452/
• 24587674 — Clock genes: their role in colorectal cancer. World journal of gastroenterology 2014. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24587674/
• 24591654 — CLOCK-controlled polyphonic regulation of circadian rhythms through canonical and noncanonical E-boxes. Molecular and cellular biology 2014. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24591654/
• 24789043 — Induction of the CLOCK gene by E2-ERα signaling promotes the proliferation of breast cancer cells. PloS one 2014. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24789043/
• 24875049 — Ras-mediated deregulation of the circadian clock in cancer. PLoS genetics 2014. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24875049/
• 25062775 — Circadian and melatonin disruption by exposure to light at night drives intrinsic resistance to tamoxifen therapy in breast cancer. Cancer research 2014. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25062775/
• 25103245 — The circadian factor Period 2 modulates p53 stability and transcriptional activity in unstressed cells. Molecular biology of the cell 2014. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25103245/
• 25175925 — Epigenetic silencing of ARNTL, a circadian gene and potential tumor suppressor in ovarian cancer. International journal of oncology 2014. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25175925/
• 25349387 — A circadian gene expression atlas in mammals: implications for biology and medicine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2014. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25349387/
• 25411341 — Association of the circadian factor Period 2 to p53 influences p53's function in DNA-damage signaling. Molecular biology of the cell 2015. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25411341/
• 25485508 — Loss of circadian clock gene expression is associated with tumor progression in breast cancer. Cell cycle (Georgetown, Tex.) 2014. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25485508/
• 25855785 — Circadian Clock Gene CRY2 Degradation Is Involved in Chemoresistance of Colorectal Cancer. Molecular cancer therapeutics 2015. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25855785/
• 25981667 — The Circadian Protein BMAL1 Regulates Translation in Response to S6K1-Mediated Phosphorylation. Cell 2015. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25981667/
• 26044300 — GENE REGULATION. Discrete functions of nuclear receptor Rev-erbα couple metabolism to the clock. Science (New York, N.Y.) 2015. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26044300/
• 26074263 — Anti-proliferative actions of a synthetic REV-ERBα/β agonist in breast cancer cells. Biochemical pharmacology 2015. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26074263/
• 26387865 — MYC Disrupts the Circadian Clock and Metabolism in Cancer Cells. Cell metabolism 2015. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26387865/
• 26407844 — A synthetic cryptochrome inhibitor induces anti-proliferative effects and increases chemosensitivity in human breast cancer cells. Biochemical and biophysical research communications 2015. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26407844/
• 26456830 — TIMELESS Forms a Complex with PARP1 Distinct from Its Complex with TIPIN and Plays a Role in the DNA Damage Response. Cell reports 2015. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26456830/
• 26768731 — Deregulated expression of cryptochrome genes in human colorectal cancer. Molecular cancer 2016. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26768731/
• 27576939 — Insulin post-transcriptionally modulates Bmal1 protein to affect the hepatic circadian clock. Nature communications 2016. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27576939/
• 27773695 — Rhythmic Oxygen Levels Reset Circadian Clocks through HIF1α. Cell metabolism 2017. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27773695/
• 27773696 — Circadian Clock Interaction with HIF1α Mediates Oxygenic Metabolism and Anaerobic Glycolysis in Skeletal Muscle. Cell metabolism 2017. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27773696/
• 27773697 — Reciprocal Regulation between the Circadian Clock and Hypoxia Signaling at the Genome Level in Mammals. Cell metabolism 2017. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27773697/
• 27834218 — Model-driven experimental approach reveals the complex regulatory distribution of p53 by the circadian factor Period 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2016. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27834218/
• 27867006 — Intercellular Coupling of the Cell Cycle and Circadian Clock in Adult Stem Cell Culture. Molecular cell 2016. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27867006/
• 27983919 — Overexpression of PER3 Inhibits Self-Renewal Capability and Chemoresistance of Colorectal Cancer Stem-Like Cells via Inhibition of Notch and β-Catenin Signaling. Oncology research 2017. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27983919/
• 27990019 — Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nature reviews. Genetics 2017. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27990019/
• 28196531 — Enhancing circadian clock function in cancer cells inhibits tumor growth. BMC biology 2017. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28196531/
• 28332504 — Correspondence: Oncogenic MYC persistently upregulates the molecular clock component REV-ERBα. Nature communications 2017. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28332504/
• 28545154 — Site-specific phosphorylation of casein kinase 1 δ (CK1δ) regulates its activity towards the circadian regulator PER2. PloS one 2017. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28545154/
• 28649228 — Ras Activity Tunes the Period and Modulates the Entrainment of the Suprachiasmatic Clock. Frontiers in neurology 2017. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28649228/
• 29099263 — Dosing time dependent in vitro pharmacodynamics of Everolimus despite a defective circadian clock. Cell cycle (Georgetown, Tex.) 2018. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29099263/
• 29216180 — The Ink4a/Arf locus operates as a regulator of the circadian clock modulating RAS activity. PLoS biology 2017. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29216180/
• 29320480 — Pharmacological activation of REV-ERBs is lethal in cancer and oncogene-induced senescence. Nature 2018. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29320480/
• 29383758 — Circadian expression and functional characterization of PEA-15 within the mouse suprachiasmatic nucleus. The European journal of neuroscience 2018. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29383758/
• 29555554 — Timeless Is a Novel Estrogen Receptor Co-activator Involved in Multiple Signaling Pathways in MCF-7 Cells. Journal of molecular biology 2018. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29555554/
• 29555767 — ASK family kinases mediate cellular stress and redox signaling to circadian clock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2018. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29555767/
• 29750810 — mTOR signaling regulates central and peripheral circadian clock function. PLoS genetics 2018. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29750810/
• 29784789 — CK1δ/ε protein kinase primes the PER2 circadian phosphoswitch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2018. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29784789/
• 30008892 — Histone deacetylase inhibitors induce the expression of tumor suppressor genes Per1 and Per2 in human gastric cancer cells. Oncology letters 2018. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30008892/
• 30296179 — Identification of valid reference genes for circadian gene-expression studies in human mammary epithelial cells. Chronobiology international 2018. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30296179/
• 30375470 — Opposite Carcinogenic Effects of Circadian Clock Gene BMAL1. Scientific reports 2018. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30375470/
• 30425162 — Distinct control of PERIOD2 degradation and circadian rhythms by the oncoprotein and ubiquitin ligase MDM2. Science signaling 2018. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30425162/
• 30428387 — Intestinal Stem Cells Exhibit Conditional Circadian Clock Function. Stem cell reports 2018. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30428387/
• 30429219 — Mutation of the gene encoding the circadian clock component PERIOD2 in oncogenic cells confers chemoresistance by up-regulating the Aldh3a1 gene. The Journal of biological chemistry 2019. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30429219/
• 30558467 — The positive circadian regulators CLOCK and BMAL1 control G2/M cell cycle transition through Cyclin B1. Cell cycle (Georgetown, Tex.) 2019. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30558467/
• 30621723 — ARNTL hypermethylation promotes tumorigenesis and inhibits cisplatin sensitivity by activating CDK5 transcription in nasopharyngeal carcinoma. Journal of experimental & clinical cancer research : CR 2019. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30621723/
• 30629587 — ERK-mediated TIMELESS expression suppresses G2/M arrest in colon cancer cells. PloS one 2019. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30629587/
• 30659176 — Differential damage and repair of DNA-adducts induced by anti-cancer drug cisplatin across mouse organs. Nature communications 2019. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30659176/
• 30769795 — The Circadian tau Mutation in Casein Kinase 1 Is Part of a Larger Domain That Can Be Mutated to Shorten Circadian Period. International journal of molecular sciences 2019. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30769795/
• 30787621 — Longdaysin inhibits Wnt/β-catenin signaling and exhibits antitumor activity against breast cancer. OncoTargets and therapy 2019. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30787621/
• 30796221 — Overexpression of Claspin and Timeless protects cancer cells from replication stress in a checkpoint-independent manner. Nature communications 2019. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30796221/
• 31030999 — Insulin/IGF-1 Drives PERIOD Synthesis to Entrain Circadian Rhythms with Feeding Time. Cell 2019. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31030999/
• 31096895 — Circadian-Hypoxia Link and its Potential for Treatment of Cardiovascular Disease. Current pharmaceutical design 2019. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31096895/
• 31217280 — Long-term, genome-wide kinetic analysis of the effect of the circadian clock and transcription on the repair of cisplatin-DNA adducts in the mouse liver. The Journal of biological chemistry 2019. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31217280/
• 31221824 — Pharmacological, Mechanistic, and Pharmacokinetic Assessment of Novel Melatonin-Tamoxifen Drug Conjugates as Breast Cancer Drugs. Molecular pharmacology 2019. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31221824/
• 31311174 — The Interplay between Colon Cancer Cells and Tumour-Associated Stromal Cells Impacts the Biological Clock and Enhances Malignant Phenotypes. Cancers 2019. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31311174/
• 31357909 — Circadian oscillations persist in low malignancy breast cancer cells. Cell cycle (Georgetown, Tex.) 2019. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31357909/
• 31604679 — Timeless-Stimulated miR-5188-FOXO1/β-Catenin-c-Jun Feedback Loop Promotes Stemness via Ubiquitination of β-Catenin in Breast Cancer. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 2020. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31604679/
• 31728273 — Periodic Oxaliplatin Administration in Synergy with PER2-Mediated PCNA Transcription Repression Promotes Chronochemotherapeutic Efficacy of OSCC. Advanced science (Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany) 2019. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31728273/
• 31825658 — Chemotherapeutic Effect of SR9009, a REV-ERB Agonist, on the Human Glioblastoma T98G Cells. ASN neuro 2019. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31825658/
• 32043967 — Casein kinase 1 dynamics underlie substrate selectivity and the PER2 circadian phosphoswitch. eLife 2020. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32043967/
• 32058954 — A Non-canonical Function of BMAL1 Metabolically Limits Obesity-Promoted Triple-Negative Breast Cancer. iScience 2020. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32058954/
• 32235701 — XPA: DNA Repair Protein of Significant Clinical Importance. International journal of molecular sciences 2020. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32235701/
• 32282334 — CK1δ as a potential therapeutic target to treat bladder cancer. Aging 2020. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32282334/
• 32292508 — SR9009 induces a REV-ERB dependent anti-small-cell lung cancer effect through inhibition of autophagy. Theranostics 2020. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32292508/
• 32354999 — Mutation of a PER2 phosphodegron perturbs the circadian phosphoswitch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2020. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32354999/
• 32372973 — A Systems Biology Approach Identifies Hidden Regulatory Connections Between the Circadian and Cell-Cycle Checkpoints. Frontiers in physiology 2020. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32372973/
• 32388500 — BMAL1 knockdown triggers different colon carcinoma cell fates by altering the delicate equilibrium between AKT/mTOR and P53/P21 pathways. Aging 2020. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32388500/
• 32706791 — Nobiletin affects circadian rhythms and oncogenic characteristics in a cell-dependent manner. PloS one 2020. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32706791/
• 32823749 — Effect of Type 2 Diabetes Mellitus on the Hypoxia-Inducible Factor 1-Alpha Expression. Is There a Relationship with the Clock Genes?. Journal of clinical medicine 2020. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32823749/
• 33093451 — TIMELESS regulates sphingolipid metabolism and tumor cell growth through Sp1/ACER2/S1P axis in ER-positive breast cancer. Cell death & disease 2020. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33093451/
• 33111200 — Transcriptome analysis of the circadian clock gene BMAL1 deletion with opposite carcinogenic effects. Functional & integrative genomics 2021. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33111200/
• 33127907 — SDE2 integrates into the TIMELESS-TIPIN complex to protect stalled replication forks. Nature communications 2020. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33127907/
• 33194597 — ASMT Regulates Tumor Metastasis Through the Circadian Clock System in Triple-Negative Breast Cancer. Frontiers in oncology 2020. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33194597/
• 33270911 — Efficacy and safety of chronomodulated irinotecan, oxaliplatin, 5-fluorouracil and leucovorin combination as first- or second-line treatment against metastatic colorectal cancer: Results from the International EORTC 05011 Trial. International journal of cancer 2021. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33270911/
• 33554778 — Bmal1 promotes prostaglandin E(2) synthesis by upregulating Ptgs2 transcription in response to increasing estradiol levels in day 4 pregnant mice. American journal of physiology. Endocrinology and metabolism 2021. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33554778/
• 33652118 — Circadian Clock Disruption Suppresses PDL1(+) Intraepithelial B Cells in Experimental Colitis and Colitis-Associated Colorectal Cancer. Cellular and molecular gastroenterology and hepatology 2021. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33652118/
• 33841513 — Identification of PCBP1 as a Novel Modulator of Mammalian Circadian Clock. Frontiers in genetics 2021. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33841513/
• 33890571 — Post-transcriptional repression of circadian component CLOCK regulates cancer-stemness in murine breast cancer cells. eLife 2021. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33890571/
• 33941065 — A Crosstalk between the Biorhythms and Gatekeepers of Longevity: Dual Role of Glycogen Synthase Kinase-3. Biochemistry. Biokhimiia 2021. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33941065/
• 33971927 — Activation of the clock gene TIMELESS by H3k27 acetylation promotes colorectal cancer tumorigenesis by binding to Myosin-9. Journal of experimental & clinical cancer research : CR 2021. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33971927/
• 34064641 — Circadian Rhythm of NER and ATR Pathways. Biomolecules 2021. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34064641/
• 34065633 — BMAL1 Knockdown Leans Epithelial-Mesenchymal Balance toward Epithelial Properties and Decreases the Chemoresistance of Colon Carcinoma Cells. International journal of molecular sciences 2021. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34065633/
• 34183658 — Restoration of the molecular clock is tumor suppressive in neuroblastoma. Nature communications 2021. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34183658/
• 34299381 — MYC Ran Up the Clock: The Complex Interplay between MYC and the Molecular Circadian Clock in Cancer. International journal of molecular sciences 2021. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34299381/
• 34301769 — Protein phosphatase 4 controls circadian clock dynamics by modulating CLOCK/BMAL1 activity. Genes & development 2021. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34301769/
• 34375638 — Circadian clock, carcinogenesis, chronochemotherapy connections. The Journal of biological chemistry 2021. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34375638/
• 34504274 — Pharmacological inhibition of cryptochrome and REV-ERB promotes DNA repair and cell cycle arrest in cisplatin-treated human cells. Scientific reports 2021. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34504274/
• 34534703 — The Circadian Clock Gene, Bmal1, Regulates Intestinal Stem Cell Signaling and Represses Tumor Initiation. Cellular and molecular gastroenterology and hepatology 2021. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34534703/
• 34536148 — Casein Kinase-1-Alpha Inhibitor (D4476) Sensitizes Microsatellite Instable Colorectal Cancer Cells to 5-Fluorouracil via Authophagy Flux Inhibition. Archivum immunologiae et therapiae experimentalis 2021. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34536148/
• 34727291 — BMAL1 induces colorectal cancer metastasis by stimulating exosome secretion. Molecular biology reports 2022. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34727291/
• 34785930 — ARNTL2 is a Prognostic Biomarker and Correlates with Immune Cell Infiltration in Triple-Negative Breast Cancer. Pharmacogenomics and personalized medicine 2021. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34785930/
• 34810213 — Concurrent Disruption of the Ras/MAPK and NF-κB Pathways Induces Circadian Deregulation and Hepatocarcinogenesis. Molecular cancer research : MCR 2022. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34810213/
• 34948470 — Glycolysis under Circadian Control. International journal of molecular sciences 2021. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34948470/
• 35034102 — Loss of circadian gene Timeless induces EMT and tumor progression in colorectal cancer via Zeb1-dependent mechanism. Cell death and differentiation 2022. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35034102/
• 35190830 — Diurnal Expression of PD-1 on Tumor-Associated Macrophages Underlies the Dosing Time-Dependent Antitumor Effects of the PD-1/PD-L1 Inhibitor BMS-1 in B16/BL6 Melanoma-Bearing Mice. Molecular cancer research : MCR 2022. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35190830/
• 35227001 — Role of CK1ε-regulated PERIOD2 in STZ-induced diabetic myocardial injury. Frontiers in bioscience (Landmark edition) 2022. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35227001/
• 35413115 — Circadian Regulator CLOCK Drives Immunosuppression in Glioblastoma. Cancer immunology research 2022. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35413115/
• 35440077 — ROR activation by Nobiletin enhances antitumor efficacy via suppression of IκB/NF-κB signaling in triple-negative breast cancer. Cell death & disease 2022. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35440077/
• 35552415 — Transcriptome analysis of clock disrupted cancer cells reveals differential alternative splicing of cancer hallmarks genes. NPJ systems biology and applications 2022. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35552415/
• 35695677 — The evolution and structure/function of bHLH-PAS transcription factor family. Biochemical Society transactions 2022. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35695677/
• 35884519 — Core-Clock Genes Regulate Proliferation and Invasion via a Reciprocal Interplay with MACC1 in Colorectal Cancer Cells. Cancers 2022. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35884519/
• 35903686 — Genome-wide CRISPR Screening Reveals Pyrimidine Metabolic Reprogramming in 5-FU Chronochemotherapy of Colorectal Cancer. Frontiers in oncology 2022. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35903686/
• 35933018 — The secondary pocket of cryptochrome 2 is important for the regulation of its stability and localization. The Journal of biological chemistry 2022. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35933018/
• 35947664 — Disruption of the circadian clock drives Apc loss of heterozygosity to accelerate colorectal cancer. Science advances 2022. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35947664/
• 35976519 — Circadian disruption alters gut barrier integrity via a ß-catenin-MMP-related pathway. Molecular and cellular biochemistry 2023. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35976519/
• 36012399 — Antiproliferative Effects of Cynara Cardunculus in Colorectal Cancer Cells Are Modulated by the Circadian Clock. International journal of molecular sciences 2022. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36012399/
• 36045116 — The trilateral interactions between mammalian target of rapamycin (mTOR) signaling, the circadian clock, and psychiatric disorders: an emerging model. Translational psychiatry 2022. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36045116/
• 36162153 — Stabilization of hypoxia-inducible factor-1α alleviates osteoarthritis via interacting with Per2 and resetting the circadian clock. Tissue & cell 2022. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36162153/
• 36170373 — Circadian disruption enhances HSF1 signaling and tumorigenesis in Kras-driven lung cancer. Science advances 2022. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36170373/
• 36357378 — SR9009 inhibits lethal prostate cancer subtype 1 by regulating the LXRα/FOXM1 pathway independently of REV-ERBs. Cell death & disease 2022. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36357378/
• 36361751 — Per1/Per2 knockout Affects Spleen Immune Function in Elderly Mice via Inducing Spleen Lymphocyte Ferroptosis. International journal of molecular sciences 2022. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36361751/
• 36432655 — Sex and Circadian Timing Modulate Oxaliplatin Hematological and Hematopoietic Toxicities. Pharmaceutics 2022. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36432655/
• 36796752 — Ribosomal S6 Kinase Regulates the Timing and Entrainment of the Mammalian Circadian Clock Located in the Suprachiasmatic Nucleus. Neuroscience 2023. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36796752/
• 36806631 — BMAL1 promotes colorectal cancer cell migration and invasion through ERK- and JNK-dependent c-Myc expression. Cancer medicine 2023. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36806631/
• 36823570 — Krüppel-like factor 9 (KLF9) links hormone dysregulation and circadian disruption to breast cancer pathogenesis. Cancer cell international 2023. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36823570/
• 36941223 — The PRMT6/PARP1/CRL4B Complex Regulates the Circadian Clock and Promotes Breast Tumorigenesis. Advanced science (Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany) 2023. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36941223/
• 37024472 — Cryptochrome 2 acetylation attenuates its antiproliferative effect in breast cancer. Cell death & disease 2023. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37024472/
• 37090313 — Chronomodulated Administration of Chemotherapy in Advanced Colorectal Cancer: A Systematic Review and Meta-Analysis. Cureus 2023. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37090313/
• 37144518 — Replisome dysfunction upon inducible TIMELESS degradation synergizes with ATR inhibition to trigger replication catastrophe. Nucleic acids research 2023. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37144518/
• 37207626 — PERIOD phosphorylation leads to feedback inhibition of CK1 activity to control circadian period. Molecular cell 2023. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37207626/
• 37240325 — The Role of REV-ERB Receptors in Cancer Pathogenesis. International journal of molecular sciences 2023. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37240325/
• 37340461 — TIMELESS upregulates PD-L1 expression and exerts an immunosuppressive role in breast cancer. Journal of translational medicine 2023. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37340461/
• 37353516 — An integrative mathematical model for timing treatment toxicity and Zeitgeber impact in colorectal cancer cells. NPJ systems biology and applications 2023. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37353516/
• 37395684 — NR1D1 Stimulates Antitumor Immune Responses in Breast Cancer by Activating cGAS-STING Signaling. Cancer research 2023. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37395684/
• 37481157 — The TIMELESS Roles in Genome Stability and Beyond. Journal of molecular biology 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37481157/
• 37569272 — Insulin Controls Clock Gene Expression in the Liver of Goldfish Probably via Pi3k/Akt Pathway. International journal of molecular sciences 2023. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37569272/
• 37593458 — The circadian clock protein Cryptochrome 1 is a direct target and feedback regulator of the Hippo pathway. iScience 2023. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37593458/
• 37601651 — E-box binding transcription factors in cancer. Frontiers in oncology 2023. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37601651/
• 37639465 — MYC disrupts transcriptional and metabolic circadian oscillations in cancer and promotes enhanced biosynthesis. PLoS genetics 2023. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37639465/
• 37831728 — Effect of miR-34a on the expression of clock and clock-controlled genes in DLD1 and Lovo human cancer cells with different backgrounds with respect to p53 functionality and 17β-estradiol-mediated regulation. PloS one 2023. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37831728/
• 38022411 — Circadian Clock REV-ERBs Agonist SR9009 Induces Synergistic Antitumor Activity in Multiple Myeloma by Suppressing Glucose-Regulated Protein 78-Dependent Autophagy and Lipogenesis. World journal of oncology 2023. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38022411/
• 38053143 — An integrative evaluation of circadian gene TIMELESS as a pan-cancer immunological and predictive biomarker. European journal of medical research 2023. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38053143/
• 38117953 — Identification of a Dual Autophagy and REV-ERB Inhibitor with in Vivo Anticancer Efficacy. Journal of medicinal chemistry 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38117953/
• 38189049 — Circadian clock and lipid metabolism disorders: a potential therapeutic strategy for cancer. Frontiers in endocrinology 2023. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38189049/
• 38199564 — Circadian modulation of glucose utilization via CRY1-mediated repression of Pdk1 expression. The Journal of biological chemistry 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38199564/
• 38255844 — Functional Characterization of Circadian Nuclear Receptors REV-ERBα and REV-ERBβ in Human Osteosarcoma Cell Cultures. International journal of molecular sciences 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38255844/
• 38319971 — Tumor circadian clock strength influences metastatic potential and predicts patient prognosis in luminal A breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38319971/
• 38336976 — The interplay between the PI3K/AKT pathway and circadian clock in physiologic and cancer-related pathologic conditions. Cell proliferation 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38336976/
• 38359290 — Mutations of the circadian clock genes Cry, Per, or Bmal1 have different effects on the transcribed and nontranscribed strands of cycling genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38359290/
• 38393943 — Poly(ADP-ribosyl)ation of TIMELESS limits DNA replication stress and promotes stalled fork protection. Cell reports 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38393943/
• 38419282 — The CK1ε/SIAH1 axis regulates AXIN1 stability in colorectal cancer cells. Molecular oncology 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38419282/
• 38420012 — Bevacizumab increases the sensitivity of olaparib to homologous recombination-proficient ovarian cancer by suppressing CRY1 via PI3K/AKT pathway. Frontiers in oncology 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38420012/
• 38466804 — The Novel ATR Inhibitor M1774 Induces Replication Protein Overexpression and Broad Synergy with DNA-targeted Anticancer Drugs. Molecular cancer therapeutics 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38466804/
• 38487270 — Timeless-Tipin interactions with MCM and RPA mediate DNA replication stress response. Frontiers in cell and developmental biology 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38487270/
• 38534356 — Hypoxic Conditions Modulate Chondrogenesis through the Circadian Clock: The Role of Hypoxia-Inducible Factor-1α. Cells 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38534356/
• 38718296 — The Circadian Clock Component RORA Increases Immunosurveillance in Melanoma by Inhibiting PD-L1 Expression. Cancer research 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38718296/
• 38777144 — Hierarchical and scaffolded phosphorylation of two degrons controls PER2 stability. The Journal of biological chemistry 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38777144/
• 38801073 — The TIMELESS and PARP1 interaction suppresses replication-associated DNA gap accumulation. Nucleic acids research 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38801073/
• 38805270 — Phosphorylation of DNA-binding domains of CLOCK-BMAL1 complex for PER-dependent inhibition in circadian clock of mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38805270/
• 38806707 — Circadian control of tumor immunosuppression affects efficacy of immune checkpoint blockade. Nature immunology 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38806707/
• 38837828 — Disruption of central and peripheral circadian clocks and circadian controlled estrogen receptor rhythms in night shift nurses in working environments. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38837828/
• 39015544 — Intrinsic PARG inhibitor sensitivity is mimicked by TIMELESS haploinsufficiency and rescued by nucleoside supplementation. NAR cancer 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39015544/
• 39058613 — Oscillatory Dynamics and Regulatory Mechanisms of the p53-Per2 Network in DNA-Damaged Cells. IEEE transactions on neural networks and learning systems 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39058613/
• 39097582 — Ferroptosis and inflammation are modulated by the NFIL3-ACSL4 axis in sepsis associated-acute kidney injury. Cell death discovery 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39097582/
• 39134242 — miRNA-mediated regulation of clock gene expression in men and women with colorectal cancer and possible consequences for disease management. Biomedical journal 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39134242/
• 39137608 — Arsenic-induced disruption of circadian rhythms and glutamine anaplerosis in human urothelial carcinoma. Journal of trace elements in medicine and biology : organ of the Society for Minerals and Trace Elements (GMS) 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39137608/
• 39169017 — Time-of-day effects of cancer drugs revealed by high-throughput deep phenotyping. Nature communications 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39169017/
• 39193850 — A majority of circadian clock genes are expressed in estrogen receptor and progesterone receptor status-dependent manner in breast cancer. Journal of biosciences 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39193850/
• 39199335 — Abnormal Histopathological Expression of Klotho, Ferroptosis, and Circadian Clock Regulators in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma: Prognostic Implications and Correlation Analyses. Biomolecules 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39199335/
• 39201344 — Computational Analyses Reveal Deregulated Clock Genes Associated with Breast Cancer Development in Night Shift Workers. International journal of molecular sciences 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39201344/
• 39268727 — LINC01232 promotes ARNTL2 transcriptional activation and inhibits ferroptosis of CRC cells through p300/H3K27ac. Epigenomics 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39268727/
• 39356670 — Isoform-specific C-terminal phosphorylation drives autoinhibition of Casein kinase 1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39356670/
• 39383000 — Functional inversion of circadian regulator REV-ERBα leads to tumorigenic gene reprogramming. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39383000/
• 39402618 — PER3 promoter hypermethylation correlates to the progression of pan-cancer. Clinical epigenetics 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39402618/
• 39501569 — Rbbp6-Mediated Bmal1 Ubiquitination Inhibits YAP1 Signaling Pathway to Promote Ferroptosis in Diabetes-Induced Testicular Damage. Diabetes & metabolism journal 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39501569/
• 39561408 — 1,3-Dichloro-2-propanol Induced Renal Cell Ferroptosis via the Circadian Clock Protein BMAL1 Targeting GPX4. Journal of agricultural and food chemistry 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39561408/
• 39733745 — PER3 suppresses tumor metastasis of oral squamous cell carcinoma by promoting HIF-1α degradation. Translational oncology 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39733745/
• 39825442 — The role of circadian rhythm regulator PERs in oxidative stress, immunity, and cancer development. Cell communication and signaling : CCS 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39825442/
• 39901247 — Cancer cells avoid ferroptosis induced by immune cells via fatty acid binding proteins. Molecular cancer 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39901247/
• 39994450 — Circadian clock features define novel subtypes among breast cancer cells and shape drug sensitivity. Molecular systems biology 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39994450/
• 40023607 — Estrogen replacement restores period 2-mediated inhibition of ferroptosis and mitigates cardiac dysfunction in estrogen-deficient rats. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40023607/
• 40127275 — Control of circadian muscle glucose metabolism through the BMAL1-HIF axis in obesity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40127275/
• 40133642 — Pharmacological targeting of BMAL1 modulates circadian and immune pathways. Nature chemical biology 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40133642/
• 40214471 — Core Molecular Clock Factors Regulate Osteosarcoma Stem Cell Survival and Behavior via CSC/EMT Pathways and Lipid Droplet Biogenesis. Cells 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40214471/
• 40230904 — Molecular docking analysis of pyrrole derivatives with different breast cancer targets. Bioinformation 2024. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40230904/
• 40241743 — BMAL1-depletion remodels ceramide metabolism to regulate ferroptosis and sorafenib chemosensitivity in acute myeloid leukemia. iScience 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40241743/
• 40241744 — Combining lineage correlations and a small molecule inhibitor to detect circadian control of the cell cycle. iScience 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40241744/
• 40269168 — BMAL1-HIF2A heterodimer modulates circadian variations of myocardial injury. Nature 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40269168/
• 40307878 — Lactate induces oxidative stress by HIF1α stabilization and circadian clock disturbance in mammary gland of dairy cows. Journal of animal science and biotechnology 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40307878/
• 40521302 — PER2 expression and cellular localization play a critical role in tumor aggressiveness and drug resistance in an in vitro model of hepatocellular carcinoma. Cancer drug resistance (Alhambra, Calif.) 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40521302/
• 40535800 — Hypoxia regulates glycolysis through the HIF-1α/BMAL1/ALDOC axis to reduce oxaliplatin sensitivity in colorectal cancer. Journal of Cancer 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40535800/
• 40564094 — Mechanism of Circadian Regulation in Ferroptosis of the BMAL1/NRF2 Pathway in Renal Ischemia-Reperfusion. Biomedicines 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40564094/
• 40585526 — Circadian metabolism in myeloid cells. Life metabolism 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40585526/
• 40591055 — Nuclear receptor subfamily 1 group D member 2 induces chemoresistance in ovarian cancer by regulating ferroptosis and immune infiltration. Discover oncology 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40591055/
• 40753759 — Clock gene ARNTL2 enhances 5-fluorouracil resistance in colon cancer by upregulating SLC7A11 to suppress ferroptosis. Redox biology 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40753759/
• 40772466 — Haoya Wang Et Al.: Circadian Rhythm Disruption Promotes Tumor Progression Through Upregulated Glycolysis. Cancer medicine 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40772466/
• 40809954 — PER1 Serves as a Tumor Suppressor in Breast Cancer by Regulating MEK5/ERK5 Signaling Pathway. International journal of general medicine 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40809954/
• 40877242 — DCAF7 recruits USP2 to facilitate hepatocellular carcinoma progression by suppressing clockophagy-induced ferroptosis. Cell death & disease 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40877242/
• 40959856 — Differential expression of ferroptosis markers, circadian regulators, KLOTHO, and classical tumor suppressors in colorectal cancer according to tumor stage: Influence of age, anatomical location, and correlation patterns. Histology and histopathology 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40959856/
• 40968534 — Markovian state models uncover casein kinase 1 dynamics that govern circadian period. Biophysical journal 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40968534/
• 40993020 — Deciphering the MYCN-driven metabolic microenvironment of neuroblastoma. Trends in molecular medicine 2026. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40993020/
• 41014359 — Casein kinase 1 family member CSNK1E can regulate proliferation and migration in hepatocellular carcinoma. Journal of cancer research and clinical oncology 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41014359/
• 41075325 — The oncogenic role of BMAL2 in non-small cell lung cancer: MRPL15-mediated regulation of apoptosis and ferroptosis. Translational oncology 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41075325/
• 41116204 — Circadian genes CLOCK and BMAL1 in cancer: mechanistic insights and therapeutic strategies. Journal of Zhejiang University. Science. B 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41116204/
• 41133664 — Reporter-Mediated Evaluation of the Circadian Oscillations of SNAIL Across In Vitro Models. Clocks & sleep 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41133664/
• 41142939 — Circadian gene Cry1 inhibits the tumorigenicity of hepatocellular carcinoma by the BAX/BCL2-mediated apoptosis pathway. Open life sciences 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41142939/
• 41174721 — NONO links circadian rhythm disruption and enhanced tumor-fibroblast crosstalk in right-sided colorectal cancer. Biomarker research 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41174721/
• 41203689 — GADD45β inhibits hepatic lipogenesis through the AMPK/SREBP1 pathway via reducing the ubiquitination-mediated degradation of SIRT1. Scientific reports 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41203689/
• 41228459 — Natural Compound Melatonin Suppresses Breast Cancer Development by Regulating Circadian Rhythm. Nutrients 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41228459/
• 41231955 — Circadian regulator REV-ERBα is a master regulator of tumor lineage plasticity and an effective therapeutic target. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41231955/
• 41257391 — C-X-C chemokine receptor CXCR4 mediates diurnal changes in the aggregation and dispersion of CD8(+) T cells within the tumor microenvironment. International journal of cancer 2026. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41257391/
• 41261416 — CLOCK-mediated acetylation of NF-κB p65 drives immune evasion in breast cancer. Biology direct 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41261416/
• 41285961 — Hif-1 responsive IFFLs to explain specific transcriptional responses to cycling hypoxia in cancers. NPJ systems biology and applications 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41285961/
• 41286322 — PER3 suppresses lung adenocarcinomatous cell proliferation/migration through activating AMPK/mTOR pathway. Scientific reports 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41286322/
• 41291151 — TIPIN coordinates ATM-dependent checkpoint and NF-κB signaling to counteract DNA replication damage from topoisomerase inhibition. Communications biology 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41291151/
• 41320098 — BMAL1-mediated circadian-ferroptosis crosstalk drives neuronal vulnerability after TBI. Free radical biology & medicine 2026. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41320098/
• 41326346 — Circadian regulation of homologous recombination by cryptochrome1-mediated dampening of DNA end resection. Nature communications 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41326346/
• 41353440 — CSNK1D inhibition suppresses head and neck squamous cell carcinoma progression through SHH and PTCH1 pathway. Cell death & disease 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41353440/
• 41354650 — Steroid hormone receptors through Cry2 are key players in the circadian clock response to serum. Nature communications 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41354650/
• 41362097 — Integration of circadian and hypoxia signaling via non-canonical heterodimerization. FEBS letters 2026. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41362097/
• 41415271 — Circadian clocks and adaptive immune function: from mechanisms to therapeutic applications. Frontiers in immunology 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41415271/
• 41465212 — The Circadian Modulators as Molecular Targets in Cancer-A Review. International journal of molecular sciences 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41465212/
• 41595646 — Circadian Clock Genes in Colorectal Cancer: From Molecular Mechanisms to Chronotherapeutic Applications. Biomedicines 2026. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41595646/
• 41641368 — TIMELESS Promotes LUAD Growth via Suppressing Transferrin-Mediated Ferroptosis and Reprograms the Tumor Microenvironment against Anti-PD-1 Immunotherapy. Cancer communications (London, England) 2026. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41641368/
• 41690951 — HIF-1α and BMAL1 in bone regeneration: crosstalk between hypoxia response and circadian rhythm. Bone research 2026. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41690951/
• 41746989 — Temporal dynamics and functional annotation of transcriptome rhythmicity in HEK293T cells. PloS one 2026. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41746989/
• 41799764 — Melatonin inhibits FAK signaling to suppress PD-L1 expression and enhance chemosensitivity in triple-negative breast cancer. International journal of medical sciences 2026. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41799764/
• 41853934 — BMAL1 modulates glutamine supply to control haematopoietic stem and progenitor cell expansion. Development (Cambridge, England) 2026. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41853934/
• 41897352 — The Small Molecule SR8278 Inhibits Cell Proliferation Independent of the REV-ERB Nuclear Receptor Proteins in Human Keratinocytes. Biomolecules 2026. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41897352/
• 41928364 — PER2 knockdown drives immunotherapy resistance in gastric cancer via metabolic reprogramming of myeloid-derived suppressor cells. Cancer & metabolism 2026. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41928364/
• 41939248 — Casein kinase 1δ/ε inhibition suppresses CLL proliferation through cell-intrinsic and microenvironmental mechanisms. HemaSphere 2026. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41939248/
• 41980678 — Time-resolved transcriptomics of FEN1 knockdown HEK293T cells identifies altered rhythmic gene expression. Gene 2026. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41980678/
• 42029117 — BMAL1 Drives Cisplatin Resistance in Non-Small Cell Lung Cancer Via Lactate-MRP1 Signaling Pathway. Thoracic cancer 2026. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/42029117/
• 42084869 — Time-of-Day Immunotherapy Administration and Outcomes in Advanced Cancers: A Systematic Review and Meta-Analysis. JAMA network open 2026. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/42084869/
• 42101677 — Circadian clock control of breast cancer hallmarks: molecular mechanisms and therapeutic implications. Cancer metastasis reviews 2026. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/42101677/
• 42134900 — Morning versus afternoon administration of immune checkpoint inhibitors in metastatic non-small-cell lung cancer. Journal for immunotherapy of cancer 2026. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/42134900/
• 42156989 — NDRG2 orchestrates circadian clock stability to suppress tumorigenesis and potentiate oxaliplatin response in colorectal cancer. Oncogene 2026. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/42156989/
• 42271186 — Porphyromonas gingivalis disrupts hippocampal circadian clock via PI3K/AKT pathway, exacerbating Alzheimer-like pathology. Alzheimer's & dementia : the journal of the Alzheimer's Association 2026. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/42271186/
• 42290481 — Nuclear CK1δ as a critical determinant of PER:CRY complex dynamics and circadian period. eLife 2026. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/42290481/
• 42316066 — Real-world evidence for the impact of circadian clock on the benefit from immune checkpoint inhibitors in solid tumors. BMC cancer 2026. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/42316066/
• 42325866 — The PER2:BRCA1:POU2F1(OCT-1) ternary complex represents a multi-component scaffold model for circadian gene regulation. Neurobiology of sleep and circadian rhythms 2026. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/42325866/